| 摘要 | 第1-12页 |
| Abstract | 第12-14页 |
| 第一章 绪论 | 第14-34页 |
| ·淀粉酶概述 | 第14-20页 |
| ·淀粉酶 | 第14-17页 |
| ·中温α-淀粉酶的来源及性质 | 第17-18页 |
| ·中温α-淀粉酶在工业中的应用 | 第18-20页 |
| ·中温α-淀粉酶的分子生物学 | 第20-21页 |
| ·中温α-淀粉酶基因 | 第20页 |
| ·中温α-淀粉酶基因的表达研究 | 第20-21页 |
| ·中温α-淀粉酶的突变研究 | 第21页 |
| ·中温α-淀粉酶生产菌株的遗传改良 | 第21-25页 |
| ·中温α-淀粉酶的分泌机制 | 第21-22页 |
| ·中温α-淀粉酶分泌的限制因素 | 第22-23页 |
| ·提高菌株α-淀粉酶分泌能力的研究进展 | 第23-24页 |
| ·中温α-淀粉酶的生产菌株及现状 | 第24页 |
| ·中温α-淀粉酶生产菌株的基因工程改良的几个问题 | 第24-25页 |
| ·本文立题依据及研究内容 | 第25-26页 |
| ·课题立题背景与意义 | 第25页 |
| ·研究内容 | 第25-26页 |
| 参考文献 | 第26-34页 |
| 第二章 中温α-淀粉酶纯化与酶学性质研究 | 第34-45页 |
| ·前言 | 第34页 |
| ·材料与方法 | 第34-37页 |
| ·菌种 | 第34页 |
| ·试剂 | 第34页 |
| ·培养基及培养条件 | 第34页 |
| ·主要仪器 | 第34-35页 |
| ·α-淀粉酶活力测定 | 第35页 |
| ·蛋白浓度测定 | 第35页 |
| ·SDS-PAGE | 第35页 |
| ·酶的分离纯化 | 第35-36页 |
| ·最适反应温度及热稳定性 | 第36页 |
| ·最适反应pH 及pH 稳定性 | 第36页 |
| ·金属离子和化学试剂对酶活力影响 | 第36页 |
| ·Km 和Vmax 测定 | 第36-37页 |
| ·薄层层析分析酶水解产物 | 第37页 |
| ·结果 | 第37-42页 |
| ·中温α-淀粉酶的纯化 | 第37-39页 |
| ·BAA 的酶学性质 | 第39-42页 |
| ·讨论 | 第42-43页 |
| 参考文献 | 第43-45页 |
| 第三章 中温α-淀粉酶基因克隆与序列分析 | 第45-57页 |
| ·前言 | 第45页 |
| ·材料与方法 | 第45-48页 |
| ·菌株 | 第45页 |
| ·工具酶和试剂 | 第45页 |
| ·培养基及培养条件 | 第45页 |
| ·主要仪器 | 第45-46页 |
| ·PCR 引物 | 第46页 |
| ·B. amyloliquefaciens CICIM B2125 基因组 DNA 提取 | 第46-47页 |
| ·16S rDNA 及 α-淀粉酶基因的 PCR 扩增 | 第47页 |
| ·PCR 产物回收 | 第47页 |
| ·α-淀粉酶基因生物信息学分析 | 第47-48页 |
| ·结果 | 第48-54页 |
| ·中温α-淀粉酶生产菌株的菌种鉴定 | 第48页 |
| ·PCR 扩增淀粉酶基因amyQ 保守片段 | 第48页 |
| ·PCR 扩增α-淀粉酶基因 | 第48-49页 |
| ·中温α-淀粉酶基因amyQ 的序列分析 | 第49-51页 |
| ·中温α-淀粉酶基因amyQ 的遗传密码分析 | 第51页 |
| ·中温α-淀粉酶的多重序列比对 | 第51-52页 |
| ·中温α-淀粉酶的遗传进化 | 第52-54页 |
| ·中温α-淀粉酶的空间结构分析 | 第54页 |
| ·讨论 | 第54-55页 |
| 参考文献 | 第55-57页 |
| 第四章 中温α-淀粉酶编码基因的功能鉴定 | 第57-70页 |
| ·前言 | 第57页 |
| ·材料与方法 | 第57-61页 |
| ·菌株、质粒 | 第57页 |
| ·工具酶和试剂 | 第57-58页 |
| ·培养基及培养条件 | 第58页 |
| ·主要仪器 | 第58页 |
| ·PCR 引物 | 第58-59页 |
| ·amyQ 的PCR 扩增 | 第59页 |
| ·DNA 片段回收、酶切、琼脂糖电泳、质粒提取、基因克隆 | 第59页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞制备与转化 | 第59页 |
| ·枯草芽孢杆菌感受态细胞制备及转化 | 第59-60页 |
| ·α-淀粉酶活力测定 | 第60页 |
| ·SDS-PAGE | 第60页 |
| ·α-淀粉酶基因amyQ′在E. coli 中的诱导表达 | 第60页 |
| ·α-淀粉酶基因amyQ 在B. subtilis 中的表达 | 第60页 |
| ·重组BAA 的纯化 | 第60页 |
| ·重组酶的酶学性质研究 | 第60页 |
| ·酶解产物HPLC 分析 | 第60-61页 |
| ·结果 | 第61-67页 |
| ·α-淀粉酶基因的PCR 扩增 | 第61页 |
| ·大肠杆菌重组载体的构建 | 第61-62页 |
| ·枯草芽孢杆菌重组载体的构建 | 第62-63页 |
| ·pET-28a-amyQ'在大肠杆菌中的诱导表达 | 第63页 |
| ·pLY-amyQ 在枯草芽孢杆菌的表达 | 第63-65页 |
| ·双水相纯化重组酶 | 第65页 |
| ·重组酶的酶学性质 | 第65-66页 |
| ·重组酶水解产物分析 | 第66-67页 |
| ·酶学性质比较分析 | 第67页 |
| ·讨论 | 第67-68页 |
| 参考文献 | 第68-70页 |
| 第五章 中温α-淀粉酶基因的定点突变研究 | 第70-84页 |
| ·前言 | 第70页 |
| ·材料与方法 | 第70-74页 |
| ·菌株、质粒 | 第70-71页 |
| ·工具酶与试剂 | 第71页 |
| ·培养基与培养条件 | 第71页 |
| ·主要仪器 | 第71页 |
| ·突变位点的确定 | 第71-72页 |
| ·定点突变引物 | 第72页 |
| ·定点突变程序 | 第72-74页 |
| ·重组载体pLY121-amyQ*的构建 | 第74页 |
| ·突变基因amyQ*在枯草芽孢杆菌中的表达 | 第74页 |
| ·BAA 突变体的酶学性质测定 | 第74页 |
| ·结果 | 第74-80页 |
| ·BAA 编码基因定点突变位点的确定 | 第74-75页 |
| ·BAA 编码基因的定点突变 | 第75-76页 |
| ·重组质粒的构建 | 第76-78页 |
| ·BAA 突变体的表达 | 第78页 |
| ·酶学性质比较与分析 | 第78-80页 |
| ·讨论 | 第80-81页 |
| 参考文献 | 第81-84页 |
| 第六章 BamHI 甲基化酶基因克隆与解淀粉芽孢杆菌B. amyloliquefaciens 电转化条件优化 | 第84-98页 |
| ·前言 | 第84-85页 |
| ·材料与方法 | 第85-88页 |
| ·菌株、质粒 | 第85-86页 |
| ·工具酶和试剂 | 第86页 |
| ·主要仪器 | 第86页 |
| ·培养基及培养条件 | 第86页 |
| ·PCR 引物 | 第86页 |
| ·B. amyloliquefaciens 基因组DNA 提取 | 第86-87页 |
| ·BamHI 甲基化酶基因克隆 | 第87页 |
| ·整合质粒pSK-metB 的构建 | 第87页 |
| ·枯草芽孢杆菌的转化 | 第87-88页 |
| ·质粒的甲基化 | 第88页 |
| ·解淀粉芽孢杆菌的电击转化 | 第88页 |
| ·转化子的验证 | 第88页 |
| ·结果 | 第88-94页 |
| ·B. amyloliquefaciens CICIM B2125 对抗生素的敏感性 | 第88-89页 |
| ·BamHI 甲基化酶基因的克隆 | 第89页 |
| ·整合质粒pSK-metB 的构建 | 第89-91页 |
| ·质粒的甲基化 | 第91-92页 |
| ·质粒甲基化对B. amyloliquefaciens 转化的影响 | 第92页 |
| ·细胞生长状态对转化的影响 | 第92页 |
| ·电场强度对转化效率的影响 | 第92-93页 |
| ·培养基对转化的影响 | 第93-94页 |
| ·质粒浓度对转化的影响 | 第94页 |
| ·讨论 | 第94-95页 |
| 参考文献 | 第95-98页 |
| 第七章 BAA 生产菌株的遗传育种 | 第98-108页 |
| ·引言 | 第98-99页 |
| ·材料与方法 | 第99-100页 |
| ·菌株、质粒 | 第99页 |
| ·工具酶与试剂 | 第99页 |
| ·培养基与培养条件 | 第99页 |
| ·主要仪器 | 第99页 |
| ·携带BAA 编码基因的多拷贝质粒载体构建 | 第99页 |
| ·B. amyloliquefaciens 的转化 | 第99页 |
| ·质粒稳定性 | 第99-100页 |
| ·发酵实验 | 第100页 |
| ·α-淀粉酶酶活力测定 | 第100页 |
| ·蛋白酶活力测定 | 第100页 |
| ·SDS-PAGE | 第100页 |
| ·结果 | 第100-104页 |
| ·amyQ 在B. amyloliquefaciens 中的表达 | 第100-101页 |
| ·重组菌质粒遗传稳定性 | 第101-102页 |
| ·提高amyQ 基因拷贝数对菌体生长的影响 | 第102页 |
| ·提高amyQ 基因拷贝数对BAA 分泌的影响 | 第102-104页 |
| ·提高amyQ 基因拷贝数对蛋白酶分泌的影响 | 第104页 |
| ·讨论 | 第104-106页 |
| 参考文献 | 第106-108页 |
| 主要结论 | 第108-110页 |
| 论文创新点 | 第110-111页 |
| 作者在攻读博士学位期间的科研成果 | 第111-112页 |
| 致谢 | 第112页 |
