| 摘要 | 第1-14页 |
| ABSTRACT | 第14-18页 |
| 缩略语表 | 第18-20页 |
| 第一章 文献综述 | 第20-48页 |
| 1 油菜病毒病的危害及病毒的生物学特性 | 第20-26页 |
| ·油菜病毒病的危害 | 第20页 |
| ·油菜三种主要病毒的生物学特性 | 第20-21页 |
| ·油菜三种主要病毒的分子生物学特性 | 第21-25页 |
| ·基因组结构 | 第21-22页 |
| ·遗传变异及株系划分 | 第22-25页 |
| ·TuMV | 第22-23页 |
| ·CMV | 第23-24页 |
| ·TMV | 第24-25页 |
| ·植物病毒的防治策略 | 第25-26页 |
| 2 植物抗病的分子机制 | 第26-28页 |
| 3 植物对病毒病抗性机制 | 第28-33页 |
| ·植物对病毒的自然抗性 | 第28-30页 |
| ·病原诱导抗病性 | 第30-31页 |
| ·病毒诱导基因沉默 | 第31-33页 |
| ·RNA介导的抗病毒机制 | 第31-32页 |
| ·转录后基因沉默机制 | 第32-33页 |
| 4 植物对三种病毒的抗性研究现状 | 第33-37页 |
| ·植物对TuMV的抗性研究 | 第33-36页 |
| ·植物对CMV的抗性研究 | 第36页 |
| ·植物对TMV的抗性研究 | 第36-37页 |
| 5 抗病基因功能研究技术 | 第37-41页 |
| ·表达谱技术 | 第37-38页 |
| ·转基因沉默技术 | 第38-41页 |
| ·转基因沉默 | 第38-39页 |
| ·RNA沉默载体 | 第39-41页 |
| 6 油菜的遗传转化方法 | 第41-43页 |
| ·组织培养的遗传转化法 | 第41-42页 |
| ·非组织培养的遗传转化法 | 第42-43页 |
| 7 转基因油菜环境安全性分析 | 第43-46页 |
| ·转基因油菜可能存在的环境风险 | 第43-44页 |
| ·转基因飘逸风险分析 | 第44-45页 |
| ·油菜开花生物学特性 | 第44页 |
| ·影响异交率的因素 | 第44-45页 |
| ·种子与基因扩散 | 第45页 |
| ·基因向近缘种扩散的可能性 | 第45页 |
| ·生态风险的监控与防范措施 | 第45-46页 |
| 8 本研究的目的与内容 | 第46-48页 |
| 第二章 油菜病毒种类血清学检测及油菜品种对芜菁花叶病毒的抗性鉴定 | 第48-57页 |
| 1 材料与方法 | 第48-51页 |
| ·实验材料 | 第48-49页 |
| ·病害样品 | 第48页 |
| ·油菜品种 | 第48-49页 |
| ·主要试剂 | 第49页 |
| ·实验方法 | 第49-51页 |
| ·病害调查和样品采集 | 第49页 |
| ·间接ELISA法鉴定病毒种类 | 第49-50页 |
| ·毒源保存及复活 | 第50页 |
| ·人工接种鉴定方法 | 第50页 |
| ·病害调查 | 第50页 |
| ·数据统计 | 第50-51页 |
| 2 结果与分析 | 第51-55页 |
| ·病毒病发生情况调查结果 | 第51-52页 |
| ·病害样品血清学检测结果 | 第52页 |
| ·病害症状与油菜类型及病毒种类的关系 | 第52-53页 |
| ·油菜品种对TuMV的抗性鉴定结果 | 第53-54页 |
| ·油菜资源材料对TuMV的抗性鉴定结果 | 第54-55页 |
| 3 讨论 | 第55-57页 |
| 第三章 芜菁花叶病毒致病力差异及壳蛋白基因序列分析 | 第57-69页 |
| 1 材料与方法 | 第57-61页 |
| ·材料 | 第57-58页 |
| ·毒源 | 第57-58页 |
| ·油菜品种 | 第58页 |
| ·方法 | 第58-61页 |
| ·毒源的保存及复活 | 第58页 |
| ·供试油菜的栽培 | 第58-59页 |
| ·接种鉴定方法 | 第59页 |
| ·病害调查及数据分析 | 第59页 |
| ·TuMV分离物总RNA的提取 | 第59页 |
| ·引物设计 | 第59页 |
| ·RT-PCR扩增病毒CP基因 | 第59-60页 |
| ·电泳检测及测序 | 第60页 |
| ·序列分析 | 第60页 |
| ·主要试剂 | 第60-61页 |
| 2 结果与分析 | 第61-67页 |
| ·TuMV分离物对油菜品种致病力差异分析 | 第61-63页 |
| ·TuMV株系核酸遗传变异分析 | 第63-67页 |
| ·TuMV CP基因RT-PCR产物电泳分析 | 第63页 |
| ·TuMV CP基因序列同源性比较 | 第63-64页 |
| ·TuMV CP核苷酸序列同源性遗传进化树分析 | 第64-67页 |
| 3 讨论 | 第67-69页 |
| 第四章 油菜花叶病毒WH株系的鉴定 | 第69-84页 |
| 1 材料与方法 | 第69-73页 |
| ·实验材料 | 第69-70页 |
| ·毒源 | 第69-70页 |
| ·抗血清 | 第70页 |
| ·植物材料 | 第70页 |
| ·实验方法 | 第70-73页 |
| ·病毒寄主范围测定 | 第70页 |
| ·病毒提纯 | 第70-71页 |
| ·提纯病毒的紫外吸收测定 | 第71页 |
| ·病毒粒体电镜观察 | 第71页 |
| ·提纯病毒与普通TMV血清学关系比较 | 第71页 |
| ·病毒dsRNA的提取 | 第71-72页 |
| ·引物设计 | 第72页 |
| ·RT-PCR扩增及电泳检测 | 第72页 |
| ·核苷酸和氨基酸序列同源性分析 | 第72-73页 |
| 2 结果与分析 | 第73-82页 |
| ·寄主范围测定 | 第73-76页 |
| ·提纯病毒紫外吸收特征及浓度 | 第76页 |
| ·提纯病毒粒子的形态观察 | 第76-77页 |
| ·YoMV-Wh与TMV血清学亲缘关系比较 | 第77-78页 |
| ·YoMV-Wh 3'末端核苷酸2283 bp cDNA片段序列分析 | 第78-82页 |
| ·RT-PCR扩增结果 | 第78页 |
| ·YoMV-Wh 3'末端核酸2283 bp cDNA片段序列和结构分析 | 第78-79页 |
| ·YoMV-Wh与同属其他病毒序列同源性比较 | 第79-81页 |
| ·YoMV-Wh与同属其他病毒遗传进化树分析 | 第81-82页 |
| 3 讨论 | 第82-84页 |
| 第五章 油菜抗病毒相关基因转化甘蓝型油菜 | 第84-112页 |
| 1 材料与方法 | 第85-96页 |
| ·材料 | 第85-86页 |
| ·植物材料 | 第85页 |
| ·菌株 | 第85页 |
| ·质粒 | 第85页 |
| ·本研究所构建的质粒 | 第85页 |
| ·主要试剂 | 第85-86页 |
| ·方法 | 第86-96页 |
| ·目的基因的挑选 | 第86页 |
| ·RNA的提取 | 第86-88页 |
| ·RNA提取方法 | 第86-87页 |
| ·DNA的消化 | 第87页 |
| ·RNA浓度测定 | 第87页 |
| ·反转录 | 第87-88页 |
| ·5'-RACE克隆非全长目的基因的全序列 | 第88-91页 |
| ·非全长基因特异性引物设计 | 第88页 |
| ·第一链cDNA的合成 | 第88-89页 |
| ·用S.N.A.P.柱子提纯cDNA | 第89页 |
| ·cDNA TdT加尾 | 第89页 |
| ·用dC-tailed cDNA作模板进行PCR | 第89-90页 |
| ·巢式扩增 | 第90-91页 |
| ·质粒DNA小量提取 | 第91页 |
| ·DNA的限制性酶切 | 第91页 |
| ·目的基因的PCR扩增 | 第91-92页 |
| ·PCR清洁试剂盒回收DNA | 第92页 |
| ·从凝胶中回收目的DNA | 第92页 |
| ·DNA片段与载体连接 | 第92-93页 |
| ·大肠杆菌感受态的制备 | 第93页 |
| ·质粒DNA转化大肠杆菌 | 第93页 |
| ·重组质粒DNA的大量提取及浓度确定 | 第93-94页 |
| ·花粉管通道法转化甘蓝型油菜 | 第94-96页 |
| ·转化时间的确定 | 第94-95页 |
| ·花粉管通道法转化步骤 | 第95-96页 |
| 2 结果与分析 | 第96-110页 |
| ·目的基因的确定 | 第96页 |
| ·RNA质量检测 | 第96页 |
| ·基因全长序列的获得 | 第96-98页 |
| ·非全长基因BN5 5'-RACE特异性引物的设计 | 第96-97页 |
| ·GSP引物特异性扩增结果 | 第97-98页 |
| ·3个目的基因序列分析 | 第98页 |
| ·植物过表达载体构建 | 第98-103页 |
| ·中间载体pG4A的构建及酶切鉴定 | 第98-100页 |
| ·目的基因植物过表达载体构建 | 第100-103页 |
| ·BN1基因植物过表达载体构建 | 第100页 |
| ·BN5基因植物过表达载体构建 | 第100-102页 |
| ·BN5基因5'端880bp片段PCR扩增 | 第101页 |
| ·BN5基因3'端1182 bp片段PCR扩增 | 第101页 |
| ·BN5基因过表达载体构建及酶切鉴定 | 第101-102页 |
| ·BN10基因植物过表达载体构建 | 第102-103页 |
| ·植物RNAi载体构建 | 第103-107页 |
| ·pRNAi-BN1载体的构建 | 第104-105页 |
| ·pRNAi-BN5载体的构建 | 第105-106页 |
| ·pRNAi-BN10载体的构建 | 第106-107页 |
| ·油菜子房授粉后花粉管伸长状况观察 | 第107-109页 |
| ·甘蓝型油菜遗传转化 | 第109-110页 |
| ·大量提取的质粒DNA浓度确定 | 第109页 |
| ·甘蓝型油菜遗传转化 | 第109-110页 |
| 3 讨论 | 第110-112页 |
| 第六章 转基因油菜的分子检测及对病毒的抗性鉴定 | 第112-128页 |
| 1 材料与方法 | 第112-118页 |
| ·材料 | 第112-113页 |
| ·植物材料 | 第112页 |
| ·除草剂 | 第112页 |
| ·毒源 | 第112-113页 |
| ·主要生物学试剂 | 第113页 |
| ·方法 | 第113-118页 |
| ·TO代转基因油菜幼苗培养 | 第113页 |
| ·除草剂筛选 | 第113页 |
| ·幼苗移栽 | 第113页 |
| ·转基因油菜基因组DNA提取 | 第113-114页 |
| ·RNA的提取 | 第114页 |
| ·转基因油菜PCR检测 | 第114页 |
| ·转基因油菜Southern blot检测 | 第114-116页 |
| ·基因组DNA的限制性内切酶酶解 | 第114-115页 |
| ·DNA酶解片段的电泳分离 | 第115页 |
| ·探针标记 | 第115页 |
| ·DNA转移与固定 | 第115-116页 |
| ·Southern杂交 | 第116页 |
| ·免疫检测 | 第116页 |
| ·转基因油菜T1代株系bar基因分离比例调查 | 第116-117页 |
| ·荧光定量PCR检测T1代转基因株系目的基因的相对表达量 | 第117页 |
| ·反应条件 | 第117页 |
| ·数据处理方法 | 第117页 |
| ·转基因油菜T1代株系病毒接种鉴定 | 第117-118页 |
| 2 结果与分析 | 第118-125页 |
| ·T0代转基因油菜的筛选及PCR鉴定 | 第118页 |
| ·转基因油菜Southern blot鉴定 | 第118-119页 |
| ·油菜基因组DNA浓度检测 | 第118-119页 |
| ·Southern blot鉴定 | 第119页 |
| ·转基因油菜性状变异观察 | 第119-122页 |
| ·转基因油菜T0代株系变异观察 | 第120-121页 |
| ·转基因油菜T1代株系变异观察 | 第121-122页 |
| ·转基因油菜T1代株系bar基因分离状况调查 | 第122-123页 |
| ·转基因油菜T1代株系目的基因荧光定量PCR分析 | 第123-124页 |
| ·PCR条件优化和特异产物扩增 | 第123页 |
| ·目的基因在转基因植株中的相对表达水平 | 第123-124页 |
| ·转基因油菜T1代株系对病毒的抗性鉴定 | 第124-125页 |
| 3 讨论 | 第125-128页 |
| 第七章 转基因油菜基因飘逸分析 | 第128-140页 |
| 1 材料与方法 | 第128-131页 |
| ·实验材料 | 第128-129页 |
| ·植物材料 | 第128-129页 |
| ·除草剂 | 第129页 |
| ·实验方法 | 第129-131页 |
| ·实验场地及装备 | 第129页 |
| ·实验设计 | 第129-130页 |
| ·调查方法 | 第130页 |
| ·抗性植株的筛选及鉴定 | 第130-131页 |
| ·数据处理 | 第131页 |
| 2 结果与分析 | 第131-137页 |
| ·非转基因植株后代中bar基因的PCR检测 | 第131-132页 |
| ·飘逸率在品种、距离和方向间的变异分析 | 第132页 |
| ·花粉飘逸的距离差异 | 第132-134页 |
| ·花粉飘逸的方向差异 | 第134页 |
| ·花粉飘逸在品种间的差异 | 第134-135页 |
| ·影响花粉飘逸的因素分析 | 第135-137页 |
| ·风对花粉飘逸的影响 | 第136页 |
| ·花期蜜蜂的数量对花粉分布的影响 | 第136-137页 |
| ·花粉空间分布 | 第137页 |
| 3 讨论 | 第137-140页 |
| 参考文献 | 第140-155页 |
| 附录1 主要试剂及溶液的配制 | 第155-161页 |
| 附录2 目的基因序列 | 第161-163页 |
| 附录3 基础载体图谱 | 第163-164页 |
| 附录4 在读期间论文发表情况 | 第164-165页 |
| 致谢 | 第165页 |
