| 目录 | 第1-10页 |
| 中文摘要 | 第10-11页 |
| ABSTRACT | 第11-13页 |
| 第一章 引言 | 第13-29页 |
| 1 PCV的分类地位 | 第13-14页 |
| 2 PCV的一般生物学特征 | 第14-19页 |
| ·PCV的理化特征 | 第14页 |
| ·PCV的细胞培养特征 | 第14-15页 |
| ·PCV的流行病学 | 第15-17页 |
| ·PCV的致病机理 | 第17-19页 |
| 3 PCV的分子生物学特征 | 第19-22页 |
| ·PCV的基因组特征 | 第19-20页 |
| ·PCV的复制和转录 | 第20页 |
| ·PCV的蛋白组成 | 第20-22页 |
| 4 PCV的检测技术 | 第22-27页 |
| ·PCV的抗原检测方法 | 第22-25页 |
| ·病毒的分离和鉴定 | 第22-23页 |
| ·常规PCR法 | 第23页 |
| ·多重PCR(multiplex PCR)法 | 第23页 |
| ·巢式PCR(nested-PCR)法 | 第23-24页 |
| ·PCR产物限制性长度多态性(PCR-RFLP)分析法 | 第24页 |
| ·竞争PCR(cPCR)法 | 第24页 |
| ·核酸探针及原位杂交(ISH)技术 | 第24页 |
| ·免疫组化法(IHC) | 第24-25页 |
| ·PCV的抗体检测方法 | 第25-27页 |
| ·酶联免疫吸附试验(ELISA)方法 | 第25-26页 |
| ·间接免疫荧光(IFA)技术 | 第26页 |
| ·免疫过氧化物酶单层细胞实验(IPMA) | 第26-27页 |
| 5 PCV感染性克隆的研究进展 | 第27-28页 |
| 6 本研究的目的及意义 | 第28-29页 |
| 第二章 猪Ⅱ型圆环病毒全基因组的克隆及进化分析 | 第29-40页 |
| 1 实验材料 | 第29-30页 |
| ·病料 | 第29页 |
| ·基因工程载体、菌株 | 第29页 |
| ·分子生物学试剂 | 第29页 |
| ·主要仪器 | 第29-30页 |
| 2 实验方法 | 第30-35页 |
| ·病毒DNA的提取 | 第30页 |
| ·引物设计 | 第30页 |
| ·PCV2全长的扩增 | 第30-31页 |
| ·PCR产物的纯化 | 第31-32页 |
| ·感受态细胞的制备 | 第32页 |
| ·pGEM-Teasy与纯化的PCR产物的连接 | 第32-33页 |
| ·连接产物转化DH5 α感受态 | 第33页 |
| ·碱裂解法小量抽提重组质粒DNA及电泳检测 | 第33-34页 |
| ·重组质粒的酶切与PCR鉴定 | 第34页 |
| ·重组质粒pT-PCV2的酶切鉴定 | 第34页 |
| ·重组质粒pT-PCV2的PCR鉴定 | 第34页 |
| ·PCV2序列分析及进化分析 | 第34页 |
| ·鉴定阳性pT-PCV2的保存 | 第34-35页 |
| 3 结果与分析 | 第35-38页 |
| ·PCV2的全基因组扩增 | 第35页 |
| ·重组质粒的酶切及PCR鉴定 | 第35-36页 |
| ·PCV2序列分析及系统进化分析 | 第36-37页 |
| ·PCV2的ORF1核苷酸序列及推导氨基酸序列同源性比较 | 第37页 |
| ·PCV2的ORF2核苷酸序列及推导氨基酸序列同源性比较 | 第37-38页 |
| 4 讨论 | 第38-40页 |
| 第三章 猪Ⅱ型圆环病毒突变体感染性克隆的构建 | 第40-52页 |
| 1 实验材料 | 第41-42页 |
| ·基因工程载体、菌株 | 第41页 |
| ·分子生物学试剂 | 第41页 |
| ·主要仪器 | 第41-42页 |
| 2 实验方法 | 第42-49页 |
| ·引物设计 | 第42页 |
| ·利用重叠延伸法定点突变PCV2 | 第42-45页 |
| ·重叠延伸法的原理 | 第42-43页 |
| ·突变体PCV2的分段扩增 | 第43-44页 |
| ·突变体PCV2全长的扩增 | 第44-45页 |
| ·突变体PCV2感染性克隆的构建 | 第45-47页 |
| ·制备pBluescriptⅡSK(+)质粒 | 第45页 |
| ·突变体PCV2全长序列和pBluescriptⅡSK(+)的酶切及回收 | 第45-46页 |
| ·突变体PCV2全长序列和pBluescriptⅡSK(+)的连接 | 第46页 |
| ·连接产物转化E.coli DH5a | 第46页 |
| ·碱裂解法小量制备质粒DNA鉴定连接产物 | 第46页 |
| ·重组质粒的PCR与酶切鉴定 | 第46-47页 |
| ·pSK-PCV2(突)序列测定 | 第47页 |
| ·突变体PCV2基因组的体外环化 | 第47页 |
| ·重组质粒超纯纯化 | 第47-48页 |
| ·转染 | 第48页 |
| ·间接免疫荧光试验(IFA) | 第48-49页 |
| 3 结果与分析 | 第49-51页 |
| ·突变体PCV2的全长序列PCR扩增 | 第49页 |
| ·重组质粒的酶切及PCR鉴定 | 第49-50页 |
| ·IFA结果 | 第50-51页 |
| 4 讨论 | 第51-52页 |
| 第四章 猪Ⅱ型圆环病毒ORF1的克隆及原核表达 | 第52-62页 |
| 1 实验材料 | 第52-53页 |
| ·基因工程载体、菌株 | 第52页 |
| ·分子生物学试剂 | 第52页 |
| ·主要仪器 | 第52-53页 |
| 2 实验方法 | 第53-57页 |
| ·引物设计 | 第53页 |
| ·ORF1的扩增 | 第53-54页 |
| ·PCR产物的纯化 | 第54页 |
| ·pGEX-4T-1-ORF1表达载体的构建 | 第54-55页 |
| ·制备pGEX-4T-1质粒 | 第54页 |
| ·ORF1序列和pGEX-4T-1的酶切及回收 | 第54-55页 |
| ·ORF1序列和pGEX-4T-1的连接 | 第55页 |
| ·连接产物转化E.coli BL21 | 第55页 |
| ·碱裂解法小量制备质粒DNA鉴定连接产物 | 第55页 |
| ·重组质粒的PCR与酶切鉴定 | 第55页 |
| ·ORF1序列测定 | 第55页 |
| ·pGEX-4T-1-ORF1的原核表达 | 第55-56页 |
| ·PAGE分析融合蛋白表达 | 第56页 |
| ·免疫印迹(western blot) | 第56-57页 |
| 3 结果与分析 | 第57-60页 |
| ·ORF1序列的PCR扩增 | 第57页 |
| ·重组质粒的酶切及PCR鉴定 | 第57-58页 |
| ·PCV2 ORF1融合蛋白表达 | 第58-59页 |
| ·PCV2 ORF1融合蛋白Western blotting | 第59-60页 |
| 4 讨论 | 第60-62页 |
| 结论 | 第62-63页 |
| 参考文献 | 第63-71页 |
| 附录一 常用试剂及配制方法 | 第71-75页 |
| 附录二 ZHEJIANG2006序列 | 第75-77页 |
| 附录三 实验载体 | 第77-80页 |
| 致谢 | 第80页 |
