| 缩略语表 | 第1-11页 |
| 中文摘要 | 第11-15页 |
| 英文摘要 | 第15-19页 |
| 前言 | 第19-22页 |
| 文献回顾一:脊髓灰质炎病毒分子生物学及作为活疫苗载体研究进展 | 第22-43页 |
| 文献回顾二:流感通用型疫苗的研究进展 | 第43-56页 |
| 本研究实验流程与技术路线 | 第56-57页 |
| 正文 | 第57-145页 |
| 第一部分 脊灰病毒 Sabi111 株基因组克隆及疫苗表达载体的构建 | 第57-91页 |
| 引言 | 第57-59页 |
| 一、实验材料 | 第59-60页 |
| 1. 试剂 | 第59页 |
| 2. 病毒、菌株和质粒 | 第59页 |
| 3. 工具酶、试剂盒等主要分子生物学试剂 | 第59-60页 |
| 4. 主要仪器设备 | 第60页 |
| 二、实验方法 | 第60-74页 |
| 1. 脊髓灰质炎病毒 Sabi111 株基因组扩增和克隆 | 第60-65页 |
| ·病毒 RNA 提取和反转录 | 第60-61页 |
| ·PCR 扩增 | 第61-62页 |
| ·PCR 产物克隆 | 第62-65页 |
| 2. 全基因组连接 | 第65-68页 |
| ·pGEM-f1 质粒修饰 | 第65页 |
| ·三片段连接 | 第65-66页 |
| ·全基因组质粒提取和鉴定 | 第66-68页 |
| 3. 将基因组改造为载体 | 第68-74页 |
| ·在载体中添加多克隆位点的策略 | 第68-69页 |
| ·重叠 PCR 导入多克隆位点 | 第69-70页 |
| ·将多克隆位点导入到基因组中 | 第70-71页 |
| ·对载体的进一步改造 | 第71-74页 |
| ·在基因组末端添加poly(A) 40结构 | 第71-72页 |
| ·在基因组前添加核酶结构 | 第72-74页 |
| ·各种载体构建 | 第74页 |
| 三、实验结果 | 第74-85页 |
| 1. Sabi111 株病毒基因组扩增和克隆 | 第74-79页 |
| ·RT-PCR 结果 | 第74页 |
| ·PV 三片段克隆及测序结果 | 第74-78页 |
| ·三片段连接为全基因组 | 第78-79页 |
| 2. 载体构建 | 第79-85页 |
| ·pGEM-PV 载体构建 | 第79-82页 |
| ·重叠延伸 PCR 方法引入多克隆位点 | 第80-82页 |
| ·将序列置换入相应质粒 | 第82页 |
| ·载体的进一步改造结果 | 第82-84页 |
| ·基因组3’-末端添加poly (A)_(40)结构 | 第82-83页 |
| ·基因组前加核酶结果 | 第83-84页 |
| ·含各种基序载体的构建结果 | 第84-85页 |
| 四、讨论 | 第85-87页 |
| 五、小结 | 第87-88页 |
| 六、参考文献 | 第88-91页 |
| 第二部分 RNA 转染实验条件优化及PV 载体感染性克隆获得 | 第91-111页 |
| 引言 | 第91-92页 |
| 一、实验材料 | 第92-93页 |
| 1. 生化试剂 | 第92页 |
| 2. 病毒、菌株和质粒 | 第92页 |
| 3. 工具酶、试剂盒等主要分子生物学试剂 | 第92-93页 |
| 4. 主要仪器设备 | 第93页 |
| 二、实验方法 | 第93-99页 |
| 1.RNA 体外合成和纯化 | 第93-96页 |
| ·质粒线性化 | 第93-94页 |
| ·体外转录 | 第94页 |
| ·RNA 纯化 | 第94-95页 |
| ·RNA 定量和纯度检查 | 第95页 |
| ·RNA 体外切割试验 | 第95-96页 |
| 2.RNA 转染实验 | 第96-98页 |
| ·Vero 细胞培养和传代 | 第96页 |
| ·转染细胞的制备 | 第96页 |
| ·RNA 转染实验 | 第96-98页 |
| ·以 Tfx-20 和 TranFast 转染 | 第96-98页 |
| ·磷酸钙转染法 | 第98页 |
| ·电穿孔法转染 | 第98页 |
| ·噬斑法测定转染效率 | 第98页 |
| 3 由载体转染复活病毒的鉴定 | 第98-99页 |
| ·病毒 RNA 提取 | 第98-99页 |
| ·PCR 扩增并鉴定 | 第99页 |
| 三、结果 | 第99-105页 |
| 1. RNA 体外转录和纯化结果 | 第99-100页 |
| 2. RNA 体外切割结果 | 第100-101页 |
| 3. PV RNA 转染筛选结果 | 第101-102页 |
| 4. 载体 RNA 转染结果 | 第102-104页 |
| 5. 载体复活病毒的鉴定 | 第104-105页 |
| 四、讨论 | 第105-108页 |
| 五、小结 | 第108-109页 |
| 六、参考文献 | 第109-111页 |
| 第三部分 重组病毒rPV-CTBM2e 和rPV-S-RBD 的制备及在细胞中表达 | 第111-145页 |
| 引言 | 第111-112页 |
| 一、实验材料 | 第112-114页 |
| 1. 生化试剂和商业抗体 | 第112-113页 |
| 2.细胞、菌株和质粒 | 第113页 |
| 3. 工具酶、试剂盒等主要分子生物学试剂 | 第113-114页 |
| 4. 主要仪器设备 | 第114页 |
| 二、试验方法 | 第114-123页 |
| 1. 抗流感 M2e 单克隆抗体制备 | 第114-117页 |
| ·M2e 多肽与载体偶联 | 第114-115页 |
| ·免疫 Balb/c 小鼠 | 第115页 |
| ·细胞融合 | 第115页 |
| ·融合细胞的筛选 | 第115页 |
| ·克隆筛选 | 第115-116页 |
| ·单抗活性检测 | 第116-117页 |
| 2. 含外源基因的重组病毒制备 | 第117-121页 |
| ·流感病毒 M2e 及霍乱弧菌CTB 融合基因制备 | 第117-119页 |
| ·霍乱弧菌 CTB 基因扩增 | 第117-118页 |
| ·CTB 与流感M2e 融合基因的获取 | 第118-119页 |
| ·SARS-CoV 蛋白受体结合区域基因扩增 | 第119-120页 |
| ·将 CTB-M2e 和 S-RBD 克隆到 PV 载体 pPV1RzA 中 | 第120-121页 |
| ·重组病毒获得 | 第121页 |
| 3. 重组病毒鉴定及生长特性研究 | 第121页 |
| ·基因扩增及测序 | 第121页 |
| ·重组病毒遗传稳定性检查 | 第121页 |
| ·重组病毒生长特性检查 | 第121页 |
| 4. 外源蛋白在细胞中表达 | 第121-123页 |
| ·溶液配制 | 第122页 |
| ·外源蛋白表达检测 | 第122-123页 |
| 三、结果 | 第123-132页 |
| 1. 流感 M2e 单克隆抗体制备和活性检测 | 第123-125页 |
| ·流感M2e 单克隆抗体制备 | 第123-124页 |
| ·M2e 单抗活性检测 | 第124-125页 |
| 2. 含外源基因重组病毒的制备 | 第125-129页 |
| ·流感 M2e 和霍乱弧菌 CTB 融合基因的克隆 | 第125-127页 |
| ·SARS-CoV S 蛋白受体结合区基因 S-RBD 克隆 | 第127-128页 |
| ·携带外源基因的重组病毒获得 | 第128-129页 |
| 3. 重组病毒的鉴定及生长特性研究 | 第129-130页 |
| ·以 RT-PCR 对重组病毒进行鉴定 | 第129页 |
| ·重组病毒遗传稳定性结果 | 第129-130页 |
| ·重组病毒生长特性结果 | 第130页 |
| 4. 外源蛋白在 Vero 细胞中表达结果 | 第130-132页 |
| 四、讨论 | 第132-136页 |
| 1. 针对第三部分的讨论 | 第132-134页 |
| 2. 针对全文的讨论 | 第134-136页 |
| 五、结论 | 第136-137页 |
| 六、小结 | 第137-139页 |
| 七、参考文献 | 第139-145页 |
| 个人简历 | 第145-147页 |
| 致谢 | 第147-149页 |
| 附录 1 pPV1RzA 载体上核酶序列 | 第149-150页 |
| 附录 2 pPV1RzA 载体上poly(A)40 序列 | 第150-151页 |
| 附录 3 pPV1RzA 载体上多克隆功能盒序列 | 第151-152页 |
| 附录 4 克隆在质粒上 CTBM2e 序列 | 第152-153页 |
| 附录 5 克隆在质粒上 Sars-RBS 序列 | 第153-155页 |
| 附录 6 重组病毒rPV-CTBM2e 中插入序列 | 第155-157页 |
| 附录 7 重组病毒rPV-Sars-RBS 中插入序列 | 第157页 |
