| 摘要 | 第1-10页 |
| Abstract | 第10-13页 |
| 缩略词表 | 第13-15页 |
| 第一章 文献综述 | 第15-37页 |
| ·研究的目的与意义 | 第15-17页 |
| ·葡萄卷叶病研究进展 | 第17-27页 |
| ·葡萄卷叶病的发生、分布及危害 | 第17-18页 |
| ·葡萄卷叶病的病原及病毒的寄主范围 | 第18页 |
| ·GLRaVs传播途径 | 第18-19页 |
| ·GLRaVs的检测方法 | 第19-20页 |
| ·GLD防治措施 | 第20-21页 |
| ·GLRaVs的分子生物学 | 第21-25页 |
| ·GLRaVs的分类及基本特性 | 第21页 |
| ·GLRaVs的基因组结构特征及主要表达产物的功能 | 第21-23页 |
| ·Closteroviridae成员基因表达策略 | 第23-25页 |
| ·GLRaV-2研究进展 | 第25-26页 |
| ·GLRaV-3研究进展 | 第26-27页 |
| ·葡萄遗传转化研究进展 | 第27-32页 |
| ·葡萄遗传转化途径 | 第27-28页 |
| ·葡萄再生系统的建立 | 第28-31页 |
| ·叶片、叶柄、茎段再生培养 | 第29-30页 |
| ·花药再生培养 | 第30-31页 |
| ·影响葡萄遗传转化的因素 | 第31-32页 |
| ·植物病毒RdRp基因介导的抗病性研究进展 | 第32-37页 |
| ·由RdRp基因介导的抗病性 | 第33-35页 |
| ·全长RdRp基因介导的抗病性 | 第33页 |
| ·由RdRp亚基介导的抗病性 | 第33-34页 |
| ·由缺失或突变的RdRp基因介导的抗病性 | 第34-35页 |
| ·RdRp基因介导的抗病机制 | 第35-36页 |
| ·展望 | 第36-37页 |
| 第二章 GLRaV-2 RdRp基因及GLRaV-3 RdRp和CP基因克隆与序列分析 | 第37-62页 |
| ·前言 | 第37页 |
| ·材料和方法 | 第37-44页 |
| ·植物材料及主要试剂 | 第37-38页 |
| ·双抗体夹心ELISA(Double Antibody Sandwich ELISA,DAS-ELISA) | 第38页 |
| ·dsRNA提取 | 第38-39页 |
| ·RT-PCR检测 | 第39页 |
| ·引物设计与合成 | 第39页 |
| ·基因克隆与序列测定 | 第39-44页 |
| ·反转录合成第一链cDNA | 第39-40页 |
| ·PCR扩增 | 第40-41页 |
| ·重叠延伸PCR扩增GLRaV-3全长RdRp基因 | 第41页 |
| ·PCR产物的纯化与回收 | 第41页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 | 第41-43页 |
| ·质粒DNA的小量制备 | 第43页 |
| ·质粒DNA的去磷酸化 | 第43-44页 |
| ·PCR产物的克隆与测序 | 第44页 |
| ·序列分析 | 第44页 |
| ·结果与分析 | 第44-60页 |
| ·GLRaVs的检测结果 | 第44-46页 |
| ·收集材料的症状表现 | 第44-45页 |
| ·DAS-ELISA检测结果 | 第45-46页 |
| ·dsRNA提取及RT-PCR | 第46页 |
| ·GLRaV-3 RdRp基因的克隆与序列分析 | 第46-52页 |
| ·GLRaV-3 RdRp基因的RT-PCR和重叠延伸 | 第46-48页 |
| ·GLRaV-3 RdRp基因序列分析 | 第48-52页 |
| ·GLRaV-3 CP基因的克隆与序列分析 | 第52-55页 |
| ·GLRaV-3 CP基因的克隆 | 第52页 |
| ·GLRaV-3 CP基因序列分析 | 第52-55页 |
| ·GLRaV-2 RdRp基因的克隆与序列分析 | 第55-60页 |
| ·GLRaV-2 RdRp基因克隆 | 第55-56页 |
| ·GLRaV-2 RdRp基因序列分析 | 第56-60页 |
| ·小结与讨论 | 第60-62页 |
| 第三章 原核表达及相应抗血清的制备 | 第62-82页 |
| ·前言 | 第62页 |
| ·材料与方法 | 第62-68页 |
| ·质粒、菌株及主要试剂 | 第62-63页 |
| ·原核表达载体的构建 | 第63-64页 |
| ·GLRaV-2 RdRp基因原核表达载体的构建 | 第63-64页 |
| ·GLRaV-3 RdRp基因原核表达载体的构建 | 第64页 |
| ·GLRaV-3 CP基因原核表达载体的构建 | 第64页 |
| ·原核表达及SDS-PAGE分析 | 第64-65页 |
| ·原核表达 | 第64页 |
| ·SDS-PAGE电泳 | 第64-65页 |
| ·GLRaV-2 CP蛋白原核表达体系的改进 | 第65页 |
| ·重组蛋白的大量制备、纯化及定量 | 第65-66页 |
| ·抗血清的制备 | 第66页 |
| ·免疫家兔 | 第66页 |
| ·抗血清的收集和保存 | 第66页 |
| ·间接ELISA(Indirect ELISA,ID-ELISA)测定抗血清的效价 | 第66-67页 |
| ·Western blotting分析 | 第67页 |
| ·制备的抗血清用于葡萄样品中的病毒检测 | 第67-68页 |
| ·A蛋白ELISA(Protein A sandwich ELISA,PAS-ELISA)检测 | 第67-68页 |
| ·斑点ELISA(Dot-blot immunobinding assay,Dot-ELISA)检测 | 第68页 |
| ·结果与分析 | 第68-80页 |
| ·原核表达载体构建 | 第68-70页 |
| ·GLRaV-2 RdRp基因原核表达载体构建 | 第68-69页 |
| ·GLRaV-3 RdRp基因原核表达载体构建 | 第69-70页 |
| ·GLRaV-3 CP基因原核表达载体构建 | 第70页 |
| ·原核表达及抗原性分析 | 第70-73页 |
| ·GLRaV-2 RdRp基因在E.coli中的诱导表达 | 第70-71页 |
| ·GLRaV-3 RdRp基因在E.coli中的表达 | 第71页 |
| ·GLRaV-3 CP基因在E.coli中的表达及抗原性分析 | 第71-73页 |
| ·用改进后的原核表达体系对GLRaV-2 CP基因进行原核表达 | 第73页 |
| ·重组蛋白的浓度测定 | 第73-75页 |
| ·ID-ELISA测定抗血清的效价 | 第75-76页 |
| ·制备的抗血清的特异性测定 | 第76-78页 |
| ·PAS-ELISA检测结果 | 第78页 |
| ·Dot-ELISA检测结果 | 第78-79页 |
| ·制备的抗血清用不同方法在病毒检测上的效果比较 | 第79-80页 |
| ·小结与讨论 | 第80-82页 |
| 第四章 GLRaV-2 RdRp基因植物表达载体构建及转化烟草研究 | 第82-101页 |
| ·前言 | 第82页 |
| ·材料和方法 | 第82-93页 |
| ·植物材料及主要试剂 | 第82-83页 |
| ·植物表达载体的构建 | 第83-85页 |
| ·以表达产生完整RdRp的cDNA植物表达载体的构建 | 第83页 |
| ·缺失编码GDD保守基元序列的RdRp基因植物表达载体的构建 | 第83-85页 |
| ·农杆菌感受态细胞的制备及转化 | 第85页 |
| ·烟草的转化、再生和筛选 | 第85-86页 |
| ·Km抗性植株的PCR检测 | 第86页 |
| ·抗性植株的Southern blotting分析 | 第86-90页 |
| ·植物总DNA的大量提取 | 第87页 |
| ·Southern杂交及检测步骤 | 第87-90页 |
| ·转基因植株的Northern Blotting分析 | 第90-93页 |
| ·植株总RNA提取 | 第90-91页 |
| ·转基因植株的Northern杂交步骤 | 第91-93页 |
| ·转基因植株的Western blotting分析 | 第93页 |
| ·结果与分析 | 第93-99页 |
| ·可以表达产生完整RdRp的cDNA植物表达载体的构建 | 第93-94页 |
| ·缺失编码GDD序列的RdRp基因植物表达载体的构建 | 第94-96页 |
| ·Km抗性烟草的获得 | 第96页 |
| ·Km抗性烟草的PCR鉴定 | 第96-97页 |
| ·Km抗性烟草的Southern杂交分析 | 第97-98页 |
| ·转基因烟草的Northern blotting分析 | 第98-99页 |
| ·转基因烟草Western blotting分析 | 第99页 |
| ·小结与讨论 | 第99-100页 |
| ·展望 | 第100-101页 |
| 第五章 葡萄遗传转化体系的建立 | 第101-118页 |
| ·前言 | 第101页 |
| ·材料和方法 | 第101-106页 |
| ·植物材料及主要试剂 | 第101-102页 |
| ·葡萄再生体系的建立 | 第102-103页 |
| ·叶片、叶柄和茎段再生培养的培养基配方 | 第102页 |
| ·叶片、叶柄和茎段愈伤组织诱导和芽再生 | 第102-103页 |
| ·花药再生培养的培养基配方 | 第103页 |
| ·花药培养的材料处理方法及培养条件 | 第103页 |
| ·GLRaV-3 RdRp基因植物表达载体构建 | 第103-104页 |
| ·GLRaV-3 RdRp基因转化烟草及鉴定 | 第104-105页 |
| ·转化烟草 | 第104页 |
| ·Km抗性烟草的分子生物学鉴定 | 第104-105页 |
| ·根癌农杆菌介导的葡萄遗传转化初步研究 | 第105-106页 |
| ·Km敏感性实验 | 第105页 |
| ·转化程序 | 第105页 |
| ·不同处理方式对葡萄遗传转化效率的影响及葡萄遗传转化 | 第105-106页 |
| ·Km抗性葡萄的PCR鉴定 | 第106页 |
| ·结果与分析 | 第106-116页 |
| ·葡萄再生体系的建立 | 第106-110页 |
| ·叶片、叶柄和茎段愈伤组织诱导概况 | 第106-107页 |
| ·不同葡萄外植体以及培养基对愈伤组织诱导效率的影响 | 第107-108页 |
| ·从愈伤组织中分化出芽的情况 | 第108-110页 |
| ·花药愈伤组织的诱导及分化 | 第110页 |
| ·GLRaV-3 RdRp基因植物表达载体的构建 | 第110-111页 |
| ·GLRaV-3 RdRp基因转化烟草及对Km抗性烟草的鉴定 | 第111-113页 |
| ·Km抗性烟草的获得 | 第111-112页 |
| ·Km抗性烟草PCR和PCR-Southern分析 | 第112页 |
| ·转基因烟草的Northern boltting分析 | 第112-113页 |
| ·葡萄遗传转化体系的初步建立 | 第113-116页 |
| ·“红地球”不同外植体对Km的敏感性实验 | 第113-114页 |
| ·不同因素对葡萄遗传转化效率影响 | 第114页 |
| ·GLRaV-3 RdRp基因转化葡萄研究 | 第114-116页 |
| ·Km抗性葡萄的PCR鉴定 | 第116页 |
| ·小结与讨论 | 第116-118页 |
| ·葡萄再生体系的优化 | 第116-117页 |
| ·不同条件对葡萄遗传转化的影响 | 第117-118页 |
| 参考文献 | 第118-131页 |
| 附录Ⅰ：实验中用植物材料及来源 | 第131-132页 |
| 附录Ⅱ：主要试剂及溶液的配制 | 第132-135页 |
| 附录Ⅲ：博士在读期间已接受的文章及会议论文 | 第135-136页 |
| 致谢 | 第136页 |
