| 摘要 | 第1-13页 |
| 英文摘要 | 第13-15页 |
| 前言 | 第15-48页 |
| 1 纤维素酶的研究进展 | 第15-46页 |
| ·纤维素概述 | 第15-16页 |
| ·纤维素的结构及构成 | 第15页 |
| ·纤维素的降解 | 第15-16页 |
| ·纤维素酶的研究进展 | 第16-39页 |
| ·纤维素酶的组成 | 第16-17页 |
| ·纤维素酶的分子结构 | 第17-19页 |
| ·纤维素酶(系)的主要性质 | 第19页 |
| ·纤维素酶立体化学催化机制 | 第19-20页 |
| ·产纤维素酶微生物 | 第20-21页 |
| ·纤维素酶的生产 | 第21页 |
| ·纤维素酶的应用 | 第21-23页 |
| ·纤维素酶的纯化研究 | 第23-25页 |
| ·纤维素酶的基因克隆 | 第25-35页 |
| ·纤维素酶基因的表达调控 | 第35-39页 |
| ·巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris表达系统 | 第39-46页 |
| ·巴斯德毕赤酵母的特性 | 第40-41页 |
| ·毕赤酵母宿主菌和表达载体的类型 | 第41-43页 |
| ·表达载体在毕赤酵母中的整合 | 第43-45页 |
| ·巴斯德毕赤酵母中信号肽的剪切过程 | 第45-46页 |
| 2 本研究的立论依据研究内容及意义 | 第46-48页 |
| 第一章 Chaetomium thermophilum CT2内切β-葡聚糖酶(EGⅡ)的分离纯化 | 第48-67页 |
| 1.材料和方法 | 第48-55页 |
| ·菌株与培养基 | 第49页 |
| ·菌株 | 第49页 |
| ·培养基 | 第49页 |
| ·主要试剂 | 第49页 |
| ·实验方法 | 第49-55页 |
| ·培养条件及粗酶液的提取 | 第49-50页 |
| ·酶活性测定 | 第50页 |
| ·内切β-葡聚糖酶EGⅡ的分离纯化 | 第50-51页 |
| ·蛋白质含量测定 | 第51-52页 |
| ·0-100μg／mL标准曲线的制作 | 第51-52页 |
| ·样品蛋白质浓度的测定 | 第52页 |
| ·考马斯亮蓝G-250试剂的配制 | 第52页 |
| ·纯度鉴定 | 第52-53页 |
| ·电泳操作步骤 | 第53页 |
| ·分子量的测定 | 第53页 |
| ·凝胶电泳方法参照生物化学实验技术手册进行。 | 第53页 |
| ·电泳迁移率的计算和标准曲线的制作 | 第53页 |
| ·分子量测定 | 第53页 |
| ·内切β-葡聚糖酶EGⅡ性质的研究 | 第53-55页 |
| 2.结果与分析 | 第55-61页 |
| ·不同培养时间对产生内切β-葡聚糖EGⅡ酶的影响 | 第55页 |
| ·C.thermophilum CT2内切β-葡聚糖酶EGⅡ的分离纯化及鉴定 | 第55-58页 |
| ·Phenyl-Sepharose疏水柱层析 | 第55-56页 |
| ·DEAE-Sepharose阴离子交换柱层析 | 第56-57页 |
| ·内切β-葡聚糖酶EGⅡ纯化过程总表 | 第57-58页 |
| ·内切β-葡聚糖酶EGⅡ的一般性质 | 第58-61页 |
| ·内切β-葡聚糖酶EGⅡ的分子量 | 第58页 |
| ·内切β-葡聚糖酶EGⅡ的最适反应温度 | 第58-59页 |
| ·内切β-葡聚糖酶EGⅡ的最适反应pH值 | 第59页 |
| ·内切β-葡聚糖酶EGⅡ的热稳定性 | 第59-60页 |
| ·不同金属离子对内切β-葡聚糖酶EGⅡ活性的影响 | 第60-61页 |
| ·N-端氨基酸序列分析 | 第61页 |
| 3.讨论 | 第61-67页 |
| ·研究结果 | 第62-63页 |
| ·研究方法 | 第63-65页 |
| ·今后还应开展的工作 | 第65-67页 |
| 第二章 嗜热毛壳菌CT2热稳定纤维二糖水解酶基因的克隆及在毕赤酵母中的高效表达 | 第67-141页 |
| 第一节：嗜热毛壳菌CT2热稳定纤维二糖水解酶Ⅱ基因的克隆及在毕赤酵母中的高效表达 | 第67-115页 |
| 1.材料和方法 | 第68-88页 |
| ·材料 | 第68-69页 |
| ·供试菌株 | 第68页 |
| ·菌株与质粒 | 第68页 |
| ·酶和生化试剂 | 第68页 |
| ·仪器 | 第68-69页 |
| ·溶液及培养基配制 | 第69页 |
| ·嗜热毛壳菌纤维二糖水解酶Ⅱ基因的cDNA克隆 | 第69-78页 |
| ·PCR引物 | 第69-70页 |
| ·总RNA的提取(Trizol法) | 第70页 |
| ·反转录cDNA第一链的合成 | 第70-71页 |
| ·目的基因cDNA中间片段的分离 | 第71-75页 |
| ·目的基因3’末端的分离 | 第75页 |
| ·目的基因5’末端的分离 | 第75-77页 |
| ·目的基因全长cDNA的克隆 | 第77页 |
| ·全长序列的生物信息学分析 | 第77-78页 |
| ·嗜热毛壳菌纤维二糖水解酶Ⅱ Genomic DNA的克隆及序列分析 | 第78-79页 |
| ·菌丝体DNA的抽提 | 第78-79页 |
| ·嗜热毛壳菌genomic DNA PCR扩增 | 第79页 |
| ·CBHⅡ的DNA序列分析 | 第79页 |
| ·嗜热毛壳菌热稳定纤维二糖水解酶Ⅱ在毕赤酵母中的高效表达 | 第79-88页 |
| ·纤维二糖水解酶CBHⅡ成熟肽基因序列的分离 | 第79-80页 |
| ·酵母表达载体的构建 | 第80页 |
| ·线性化质粒DNA制备 | 第80-81页 |
| ·酵母转化 | 第81-82页 |
| ·酵母转化子的筛选与鉴定 | 第82-85页 |
| ·外源基因多拷贝整合转化子筛选 | 第85-86页 |
| ·酵母工程菌的培养和纤维二糖水解酶Ⅱ的诱导分泌表达 | 第86页 |
| ·表达产物的生物学活性检测及表达产物的SDS-PAGE分析 | 第86-87页 |
| ·纤维二糖水解酶Ⅱ工程菌表达产物的纯化及酶学性质 | 第87-88页 |
| 2 结果与分析 | 第88-115页 |
| ·C.thermophilum CT2总RNA的提取 | 第88-89页 |
| ·纤维二糖水解酶cbh2基因中间片段的分离 | 第89-91页 |
| ·C.thermophilum CT2纤维二糖水解酶cbh2基因中间片段的分离 | 第89-91页 |
| ·C.thermophilum CT2纤维二糖水解酶cbh2基因3’-末端cDNA的分离 | 第91-92页 |
| ·C.thermophilum CT2纤维二糖水解酶Ⅱ基因cDNA5’-末端的分离 | 第92-93页 |
| ·C.thermophilum CT2纤维二糖水解酶cbh2基因全长cDNA的分离及扩增片段的序列拼接 | 第93-94页 |
| ·C.thermophilum CT2纤维二糖水解酶Ⅱgenomic DNA的扩增 | 第94-98页 |
| ·纤维二糖水解酶Ⅱ基因的核苷酸序列和氨基酸序列分析 | 第98-102页 |
| ·纤维二糖水解酶Ⅱ基因cbh2的核苷酸序列分析 | 第98-99页 |
| ·纤维二糖水解酶Ⅱ基因cbh2的氨基酸序列分析 | 第99-102页 |
| ·纤维二糖水解酶Ⅱ成熟肽基因序列的分离 | 第102-103页 |
| ·纤维二糖水解酶Ⅱ基因cbh2在毕赤酵母中的表达 | 第103-109页 |
| ·酵母表达载体的构建和鉴定 | 第103-106页 |
| ·重组酵母表达质粒pPIC9K／cbh2转化Pichia pastoris GS115及酵母转化子的筛选 | 第106-109页 |
| ·嗜热毛壳菌热稳定纤维二糖水解酶cbh2基因在Pichia pastoris中的高效表达及表达产物的检测 | 第109-115页 |
| ·纤维二糖水解酶cbh2基因在Pichia pastoris中的诱导表达和高表达酵母菌株的筛选 | 第109页 |
| ·纤维二糖水解酶Ⅱ酵母工程菌产酶SDS-PAG电泳分析 | 第109页 |
| ·纤维二糖水解酶Ⅱ基因cbh2表达产物的分析 | 第109-111页 |
| ·纤维二糖水解酶酵母工程菌的遗传稳定性分析 | 第111页 |
| ·表达纤维二糖水解酶Ⅱ的纯化及酶学性质研究 | 第111-115页 |
| 第二节：嗜热毛壳菌热稳定纤维二糖水解酶Ⅰ在毕赤酵母中的高效表达 | 第115-132页 |
| 1 实验材料 | 第115页 |
| 2 实验方法 | 第115-120页 |
| ·嗜热毛壳菌CT2纤维二糖水解酶cbh1基因的扩增、克隆及序列测定 | 第115-117页 |
| ·嗜热毛壳菌总RNA的提取 | 第115页 |
| ·引物设计 | 第115-116页 |
| ·纤维二糖水解酶cbh1基因的PCR扩增 | 第116页 |
| ·纤维二糖水解酶cbh1基因PCR产物的克隆及序列测定 | 第116-117页 |
| ·纤维二糖水解酶基因cbh1重组酵母分泌型表达载体的构建和鉴定 | 第117-119页 |
| ·cbh1重组酵母表达载体的构建 | 第117页 |
| ·pPIC9K／cbh1阳性克隆的筛选和鉴定方法 | 第117页 |
| ·重组表达质粒转化毕赤酵母及酵母转化子的筛选 | 第117-118页 |
| ·酵母转化子的筛选与鉴定及多拷贝整合转化子筛选 | 第118-119页 |
| ·嗜热毛壳菌CT2纤维二糖水解酶Ⅰ基因在毕赤酵母中的高效表达与表达产物的检测 | 第119-120页 |
| ·酵母工程菌的培养和纤维二糖水解酶的诱导分泌表达 | 第119页 |
| ·表达产物的生物学活性检测及表达产物的SDS-PAGE分析 | 第119-120页 |
| 3 实验结果与分析 | 第120-132页 |
| ·嗜热毛壳菌纤维二糖水解酶Ⅰ基因的PCR扩增及序列测定 | 第120-123页 |
| ·C.thermophilum CT2 RNA提取 | 第120页 |
| ·纤维二糖水解酶cbh1基因的PCR扩增 | 第120-121页 |
| ·纤维二糖水解酶Ⅰ基因扩增产物的克隆和重组质粒pGEM-T/cbh1 的酶切鉴定 | 第121页 |
| ·嗜热毛壳菌纤维二糖水解酶cbh1基因序列测定与分析 | 第121-123页 |
| ·嗜热毛壳菌纤维二糖水解酶cbh1基因分泌型重组酵母表达载体的构建和鉴定 | 第123-127页 |
| ·重组酵母表达质粒pPIC9K／cbh1电击转化Pichia pastoris及酵母转化子的筛选 | 第127-129页 |
| ·酵母转化子的甲醇利用表型筛选 | 第127页 |
| ·酵母转化子的PCR鉴定 | 第127-128页 |
| ·cbh1基因多拷贝整合子筛选 | 第128-129页 |
| ·嗜热毛壳菌纤维二糖水解酶cbh1基因在Pichia pastoris中的高效表达与表达产物的检测 | 第129-132页 |
| ·纤维二糖水解酶cbh1基因在Pichia pastoris中的诱导表达与高表达菌株的筛选 | 第129页 |
| ·cbh1基因表达产物的SDS-PAGE分析和检测 | 第129-130页 |
| ·纤维二糖水解酶Ⅰ基因cbh1表达产物的分析 | 第130页 |
| ·表达纤维二糖水解酶Ⅰ最适合温度及温度稳定性 | 第130-132页 |
| 第三节 讨论与分析 | 第132-141页 |
| 1.嗜热毛壳菌C.thermophilum CT2总RNA提取 | 第132页 |
| 2 利用保守的氨基酸序列克隆纤维二糖水解酶等纤维素酶的策略 | 第132-133页 |
| 3 影响Pichia pastoris表达系统表达重组纤维二糖水解酶的因素 | 第133-136页 |
| 4.实现外源蛋白在毕赤酵母表达系统中高效表达的策略 | 第136-141页 |
| ·目的基因的特性 | 第136页 |
| ·启动子选择 | 第136-137页 |
| ·mRNA的非翻译区(UTR) | 第137页 |
| ·起始密码子ATG的旁侧序列 | 第137页 |
| ·表达菌株的甲醇利用表型与表达盒的染色体整合位点和方式 | 第137-138页 |
| ·基因剂量 | 第138页 |
| ·分泌表达 | 第138-139页 |
| ·翻译后修饰 | 第139页 |
| ·产物稳定性 | 第139-140页 |
| ·发酵条件 | 第140-141页 |
| 第三章 结论和建议 | 第141-143页 |
| 1 结论 | 第141-142页 |
| 2 建议 | 第142-143页 |
| 参考文献 | 第143-157页 |
| 致谢 | 第157-158页 |
| 攻读硕士期间发表的论文和专利 | 第158页 |
