| 摘要 | 第1-8页 |
| Abstract | 第8-10页 |
| 前言 | 第10-15页 |
| 第一部分 羟胺切割Neurturin融合蛋白表达载体的构建、在大肠杆菌中表达和产物纯化 | 第15-23页 |
| 一、实验材料和方法 | 第15-18页 |
| (一)、实验材料 | 第15-16页 |
| 1.质粒和菌株 | 第15页 |
| 2.工具酶及试剂 | 第15-16页 |
| 3.引物 | 第16页 |
| (二)、实验方法 | 第16-18页 |
| 1.含羟胺切点的pThioHisA—hNTN表达载体的构建 | 第16-17页 |
| 2.含羟胺切点的pThioHisA—hNTN在大肠杆菌中的表达 | 第17页 |
| 3.融合蛋白的羟胺切割及产物纯化 | 第17页 |
| 4.EhNTN的复性 | 第17-18页 |
| 5.纯化的EhNTN的非还原SDS-PAGE电泳鉴定 | 第18页 |
| 6.表达产物的Western blot分析 | 第18页 |
| 二、结果和分析 | 第18-21页 |
| (一)、含羟胺切割位点pThioHisA—hNTN表达载体的构建 | 第18-19页 |
| (二)、含羟胺位点pThioHisA—hNTN融合蛋白在大肠杆菌中表达 | 第19-20页 |
| (三)、融合蛋白的羟胺切割及纯化 | 第20页 |
| (四)、纯化的EhNTN的非还原电泳结果 | 第20-21页 |
| (五)、表达产物的Western blot分析结果 | 第21页 |
| 三、讨论 | 第21-23页 |
| 第二部分 神经营养因子Neurturin在毕赤酵母中分泌表达、纯化 | 第23-36页 |
| 一、实验材料和方法 | 第23-27页 |
| (一)、实验材料 | 第23-24页 |
| 1.菌株和质粒 | 第23-24页 |
| 2.工具酶和试剂 | 第24页 |
| (二)、实验方法 | 第24-27页 |
| 1.NTN全基因合成 | 第24-25页 |
| 2.α-hNTN融合基因的获得 | 第25-26页 |
| 3.pPIC9K-α-hNTN表达载体的构建 | 第26页 |
| 4.转化毕赤酵母GS115 | 第26页 |
| 5.G418筛选多拷贝转化子 | 第26页 |
| 6.在毕赤酵母菌中诱导表达重组的人NTN | 第26页 |
| 7.Western blot分析 | 第26页 |
| 8.毕赤酵母表达的YhNTN的纯化 | 第26-27页 |
| 9.纯化的YhNTN的非还原SDS-PAGE电泳鉴定 | 第27页 |
| 10.重组蛋白糖含量分析 | 第27页 |
| 二、结果和分析 | 第27-31页 |
| (一)、人NTN全基因合成及α-hNTN融合基因的获得 | 第27-28页 |
| (二)、pPIC9K-hNTN表达载体的构建及序列分析 | 第28页 |
| (三)、转化毕赤酵母GS115并筛选稳定的多拷贝转化子 | 第28页 |
| (四)、在毕赤酵母中诱导表达重组的人NTN | 第28页 |
| (五)、Western Blot分析结果 | 第28-29页 |
| (六)、毕赤酵母表达YhNTN的纯化 | 第29页 |
| (七)、纯化的YhNTN的非还原电泳结果 | 第29-31页 |
| (八)、重组蛋白糖含量分析 | 第31页 |
| 三、讨论 | 第31-36页 |
| 第三部分 重组hNTN的生物学活性鉴定 | 第36-58页 |
| 一、实验材料和方法 | 第36-39页 |
| (一)、实验材料 | 第36-37页 |
| 1.试剂及抗体 | 第36页 |
| 2.培养基及重组蛋白 | 第36-37页 |
| 3.实验动物 | 第37页 |
| (二)、实验方法 | 第37-39页 |
| 1.鸡胚背根神经节培养实验 | 第37页 |
| 2.胚胎大鼠中脑多巴胺能神经元培养实验 | 第37-38页 |
| (1) 多巴胺能神经元细胞培养 | 第37页 |
| (2) 酪氨酸羟化酶(TH)免疫细胞化学染色观察体外培养的神经元 | 第37-38页 |
| 3.重组hNTN对大鼠面神经损伤的保护作用 | 第38页 |
| (1) 实验动物及分组 | 第38页 |
| (2) 面神经损伤模型的建立及观察重组hNTN对神经元的保护作用 | 第38页 |
| 4.重组hNTN对恒河猴帕金森氏病模型中多巴胺能神经元的保护作用 | 第38-39页 |
| (1) 动物分组与用药 | 第38页 |
| (2) 神经生化测定 | 第38-39页 |
| (3) 组织病理切片 | 第39页 |
| 二、结果与分析 | 第39-54页 |
| (一)、鸡胚背根神经节培养 | 第39页 |
| (二)、胚胎大鼠中脑多巴胺能神经元培养 | 第39-46页 |
| 1.多巴胺能神经元细胞活体直接观察 | 第39-42页 |
| 2.TH免疫细胞学化染色观察结果 | 第42-46页 |
| (三)、大鼠面神经损伤模型实验结果 | 第46-48页 |
| 1.组织病理切片观察 | 第46页 |
| 2.面神经核观察及记数 | 第46-48页 |
| (四)、恒河猴帕金森氏病模型实验结果 | 第48-54页 |
| 1.行为观察 | 第48-50页 |
| (1) 急性反应 | 第48-49页 |
| (2) PD症状 | 第49-50页 |
| 2.神经生化改变 | 第50-52页 |
| 3.神经病理改变 | 第52-54页 |
| 三、讨论 | 第54-58页 |
| 小结 | 第58-59页 |
| 展望 | 第59-60页 |
| 论文参考文献 | 第60-67页 |
| 论文综述1 | 第67-80页 |
| 论文综述2 | 第80-93页 |
| 附录 | 第93-108页 |
| 致谢 | 第108-109页 |
| 研究生简历 | 第109页 |
