| 中文摘要 | 第1-9页 |
| 英文摘要 | 第9-12页 |
| 前言 | 第12-24页 |
| 1．基因治疗策略概述 | 第12-17页 |
| a 病毒载体介导的基因添加策略的研究现状 | 第12-14页 |
| b 基于同源重组技术的基因修复策略的研究现状 | 第14-16页 |
| c 寡核苷酸基因疗法进展 | 第16-17页 |
| 2．寡核苷酸介导的基因定点修复 | 第17-20页 |
| a 杂合寡核苷酸介导的基因定点修复 | 第17-19页 |
| b 单链DNA寡核苷酸介导的基因定点修复 | 第19-20页 |
| 3．定点修复机制研究的进展 | 第20-22页 |
| 4．本课题的设计概述 | 第22-24页 |
| 材料与方法 | 第24-43页 |
| 一、材料 | 第24-26页 |
| 1．菌株与质粒 | 第24页 |
| 2．细胞系 | 第24页 |
| 3．限制性内切酶及其它修饰酶类 | 第24页 |
| 4．转染试剂 | 第24页 |
| 5．寡核苷酸 | 第24页 |
| 6．抗体 | 第24-25页 |
| 7．其它主要试剂及试剂盒 | 第25页 |
| 8．主要仪器设备 | 第25页 |
| 9．放射性核素 | 第25-26页 |
| 二、实验方法 | 第26-43页 |
| 基本技术路线流程图 | 第26页 |
| 1．质粒的构建 | 第26-29页 |
| 1．1．酶切反应 | 第26页 |
| 1．2．DNA片段回收 | 第26-27页 |
| 1．3．DNA片段3’凹端的补平 | 第27页 |
| 1．4．DNA片段3’凸端的削平 | 第27页 |
| 1．5．载体的脱磷酸化 | 第27页 |
| 1．6．连接反应 | 第27-28页 |
| 1．7．感受态大肠杆菌细胞制备 | 第28页 |
| 1．8．转化 | 第28页 |
| 1．9．质粒DNA的小量制备 | 第28页 |
| 1．10．质粒DNA的大量制备 | 第28-29页 |
| 2．细胞培养 | 第29页 |
| 2．1 G418溶液的配制 | 第29页 |
| 2．2 细胞生长条件 | 第29页 |
| 2．3 细胞传代 | 第29页 |
| 2．4 细胞复苏及冻存 | 第29页 |
| 3．电穿孔法转染DNA | 第29-30页 |
| 4．Southern Blot分析 | 第30-32页 |
| 4．1 基因组DNA的提取 | 第30页 |
| 4．2 Southern Blot分析 | 第30-32页 |
| 4．2．1 酶解 | 第31页 |
| 4．2．2 电泳 | 第31页 |
| 4．2．3．转膜 | 第31页 |
| 4．2．4．预杂交 | 第31页 |
| 4．2．5 DNA探针标记 | 第31页 |
| 4．2．6 杂交 | 第31页 |
| 4．2．7 洗膜及放射自显影 | 第31-32页 |
| 5．寡核苷酸的基因转移 | 第32-33页 |
| 5．1．Lipofectamine 2000法转染DNA | 第32页 |
| 5．2．Oligofectamine法转染DNA | 第32页 |
| 5．3．Effectene法转染DNA | 第32-33页 |
| 6．荧光显微镜下观察定点修复的发光细胞 | 第33页 |
| 7．FACS定量分析发光细胞比例 | 第33页 |
| 8．寡核苷酸介导基因定点修复的细胞周期定位 | 第33-34页 |
| 8．1．细胞周期同步化试剂的配置 | 第33页 |
| 8．2．细胞周期同步化 | 第33-34页 |
| 8．2．1．去血清培养使细胞同步于G0期 | 第33页 |
| 8．2．2．Mimosine使细胞同步于G1晚期 | 第33-34页 |
| 8．2．3．Thymidine使细胞同步于S期及G1／S交界处 | 第34页 |
| 8．2．4．Nocodazole使细胞同步于分裂期 | 第34页 |
| 9．流式细胞仪测定细胞DNA含量 | 第34-35页 |
| 9．1．收集细胞 | 第34页 |
| 9．2．PI染色法测定细胞周期 | 第34-35页 |
| 10．PCR扩增待检测片段 | 第35页 |
| 10．1．从哺乳动物细胞中分离基因组DNA | 第35页 |
| 10．2．PCR反应引物的设计及序列 | 第35页 |
| 11．等位基因特异PCR法检测寡核苷酸的基因定点突变 | 第35-37页 |
| 12．限制性内切酶片段长度多态性(RFLP)分析定点突变作用 | 第37页 |
| 13．流式细胞仪分选富集纠正后的发光细胞 | 第37页 |
| 14．免疫组织化学检测细胞GFP蛋白的表达状况 | 第37-38页 |
| 15．菌落杂交鉴定修复基因 | 第38-39页 |
| 15．1．巢式PCR扩增待测片段插入T载体 | 第38页 |
| 15．2．细菌转化 | 第38页 |
| 15．3．将菌落影印至NC膜上 | 第38页 |
| 15．4．菌落的裂解与DNA的固定 | 第38页 |
| 15．5．寡核苷酸探针的设计与合成 | 第38-39页 |
| 15．6．杂交 | 第39页 |
| 16．Western blotting检测GFP蛋白的表达水平 | 第39-42页 |
| 16．1．裂解细胞 | 第39-40页 |
| 16．2．SDS-PAGE电泳 | 第40-41页 |
| 16．3．电转移 | 第41页 |
| 16．4．杂交 | 第41-42页 |
| 17．半定量RT-PCR检测基因的mRNA表达水平 | 第42-43页 |
| 17．1 从细胞中提取细胞总RNA | 第42页 |
| 17．2 反转录成cDNA第一链 | 第42页 |
| 17．3 半定量RT-PCR | 第42-43页 |
| 实验结果 | 第43-73页 |
| 一、哺乳动物细胞EGFP荧光报告系统的建立 | 第43-47页 |
| 1．突变EGFP基因,构建真核表达质粒 | 第43-45页 |
| 2．HeLa-mEGFP细胞株的建立 | 第45-47页 |
| 二、寡核苷酸进行基因定点修复 | 第47-52页 |
| 1．针对mEGFP突变位点合成打靶分子 | 第47-50页 |
| 2. 针对mEGFP基因点突变的基因定点修复 | 第50-52页 |
| 三、单链寡核苷酸介导的基因定点修复的机制研究 | 第52-65页 |
| 1．细胞周期同步化 | 第52-53页 |
| 2．基因定点修复反应在细胞周期中的定位 | 第53-54页 |
| 3．复制抑制与S期修复效率的相关性分析 | 第54-55页 |
| 4．Thymidine介导的复制停滞时间与修复效率的相关性分析 | 第55-58页 |
| 5．转染前Thymidine抑制时间与修复效率的关系 | 第58-60页 |
| 6．RT-PCR检测Rad51和P53在thymidine作用下的表达变化 | 第60-61页 |
| 7．Thymidine作用下DNA合成的渗漏现象 | 第61-62页 |
| 8．复制叉渗漏与提高修复效率的相关性分析 | 第62-64页 |
| 9．S期基因定点修复的链偏向性分析 | 第64-65页 |
| 四、多水平检测寡核苷酸介导的靶向基因定点修复 | 第65-73页 |
| 1．等位基因特异PCR法检测寡核苷酸的基因定点突变 | 第65-67页 |
| 2．流式分选的荧光细胞DNA水平的分析 | 第67-69页 |
| 3．细菌克隆杂交筛选纠正基因 | 第69-70页 |
| 4．DNA测序 | 第70页 |
| 5．免疫组化与蛋白印迹检测EGFP蛋白的表达 | 第70-73页 |
| 讨论 | 第73-80页 |
| 一、利用荧光报告系统研究基因定点修复的优越性 | 第73-74页 |
| 二、揭示寡核苷酸的作用机制是提高修复效率的根本条件 | 第74-75页 |
| 三、S期中的寡核苷酸 | 第75-77页 |
| 四、复制叉配对寡核苷酸掺入假说 | 第77-78页 |
| 五、寡核苷酸作用中链的偏向性分析 | 第78-79页 |
| 六、基因定点修复策略的应用前景 | 第79-80页 |
| 小结 | 第80-81页 |
| 参考文献 | 第81-85页 |
| 文献综述 | 第85-101页 |
| 英文名词及缩写 | 第101-102页 |
| 个人简历 | 第102-103页 |
| 致谢 | 第103页 |
