| 致谢 | 第1-10页 |
| 英文缩略词(ABBREVIATION) | 第10-12页 |
| 摘要 | 第12-14页 |
| Abstract | 第14-16页 |
| 第一章 文献综述 | 第16-36页 |
| ·TRAIL与肿瘤治疗 | 第16-28页 |
| ·引言 | 第16页 |
| ·TRAIL及其受体 | 第16-19页 |
| ·TRAIL的凋亡诱导机理 | 第19-23页 |
| ·TRAIL的凋亡诱导途径 | 第19-20页 |
| ·影响TRAIL凋亡诱导活性的因素和途径 | 第20-23页 |
| ·TRAIL在肿瘤治疗上的应用 | 第23-28页 |
| ·TRAIL抗肿瘤活性 | 第24-25页 |
| ·TRAIL与其他药物联合应用 | 第25页 |
| ·TRAIL对正常细胞的潜在毒性 | 第25-27页 |
| ·TRAIL的临床研究 | 第27-28页 |
| ·卷曲螺旋结构 | 第28-33页 |
| ·卷曲螺旋的概述 | 第28-29页 |
| ·卷曲螺旋的结构特征 | 第29-31页 |
| ·卷曲螺旋与融合蛋白的构建 | 第31-33页 |
| ·本研究的研究目的与研究内容 | 第33-36页 |
| 第二章 人可溶性TRAIL和ZS-TRAIL的基因克隆、表达及纯化 | 第36-73页 |
| ·前言 | 第36-37页 |
| ·材料 | 第37-42页 |
| ·菌种和质粒 | 第37页 |
| ·主要试剂 | 第37-38页 |
| ·培养基和缓冲液的配制 | 第38-41页 |
| ·主要仪器 | 第41-42页 |
| ·方法 | 第42-54页 |
| ·TRAIL114-281 cDNA的扩增 | 第42-45页 |
| ·人外周血单个核细胞的分离 | 第42页 |
| ·外周血单个核细胞培养和激活 | 第42-43页 |
| ·外周血单个核细胞总RNA的抽提 | 第43页 |
| ·RT-PCR反应 | 第43-45页 |
| ·引物设计 | 第43-44页 |
| ·RT-PCR扩增 | 第44-45页 |
| ·ZS-TRAIL序列的扩增 | 第45-46页 |
| ·ZS的合成 | 第45页 |
| ·重叠延伸PCR技术扩增ZS-TRAIL | 第45-46页 |
| ·重组质粒的构建 | 第46-49页 |
| ·PCR产物及质粒的酶切 | 第46页 |
| ·酶切产物电泳并割胶回收 | 第46-47页 |
| ·外源DNA与质粒的连接 | 第47页 |
| ·感受态细胞的制备 | 第47页 |
| ·连接产物转化大肠杆菌感受态细胞 | 第47-48页 |
| ·转化子的挑选及鉴定 | 第48-49页 |
| ·菌落PCR | 第48-49页 |
| ·小批量质粒DNA的抽提 | 第49页 |
| ·双酶切及测序 | 第49页 |
| ·工程菌的诱导表达 | 第49-50页 |
| ·SDS-PAGE电泳 | 第50-51页 |
| ·发酵罐规模的发酵 | 第51页 |
| ·表达蛋白的分离纯化 | 第51-52页 |
| ·目的蛋白的鉴定-Western blot检验 | 第52-53页 |
| ·蛋白浓度的测定-BCA法 | 第53页 |
| ·纯度鉴定-HPLC | 第53-54页 |
| ·目的蛋白分子量的鉴定-ESI质谱 | 第54页 |
| ·二、三级结构的分析-CD法 | 第54页 |
| ·结果 | 第54-69页 |
| ·TRAIL114-281 cDNA的扩增 | 第54页 |
| ·ZS-TRAIL序列的扩增 | 第54-56页 |
| ·重组质粒的构建 | 第56-59页 |
| ·工程菌的诱导表达 | 第59-60页 |
| ·发酵罐规模的发酵 | 第60页 |
| ·表达蛋白的分离纯化 | 第60-63页 |
| ·目标蛋白的鉴定-Western blot检验 | 第63-64页 |
| ·纯度鉴定-HPLC | 第64-65页 |
| ·目的蛋白分子量的鉴定-ESI质谱 | 第65-68页 |
| ·二、三级结构的分析-CD法 | 第68-69页 |
| ·讨论 | 第69-72页 |
| ·人TRAIL和ZS-TRAIL基因的克隆表达 | 第69-70页 |
| ·基因工程菌的发酵及目的蛋白的纯化 | 第70-71页 |
| ·纯化产物的质量分析 | 第71-72页 |
| ·本章小结 | 第72-73页 |
| 第三章 ZS-TRAIL和TRAIL体内外抗肿瘤活性比较 | 第73-92页 |
| ·前言 | 第73-74页 |
| ·材料 | 第74-75页 |
| ·细胞株 | 第74页 |
| ·实验动物 | 第74页 |
| ·荷瘤裸鼠模型 | 第74页 |
| ·试剂 | 第74-75页 |
| ·主要溶液的配制 | 第75页 |
| ·仪器 | 第75页 |
| ·方法 | 第75-78页 |
| ·ZS-TRAIL和TRAIL体外抗肿瘤活性的测定 | 第75-77页 |
| ·细胞培养 | 第75-76页 |
| ·SRB法检测细胞生长抑制率 | 第76-77页 |
| ·ZS-TRAIL和TRAIL体内抗肿瘤活性的测定:荷瘤裸鼠模型 | 第77-78页 |
| ·荷人肠癌HCT-8裸鼠模型 | 第77-78页 |
| ·荷人肺腺癌SPC-A1裸鼠模型 | 第78页 |
| ·肝功能生化指标的测试 | 第78页 |
| ·统计学方法 | 第78页 |
| ·实验结果 | 第78-90页 |
| ·体外抗肿瘤活性 | 第78-81页 |
| ·ZS-TRAIL和TRAIL对荷人肠癌HCT-8裸鼠模型的抗肿瘤作用 | 第81-85页 |
| ·ZS-TRAIL和TRAIL对荷人肺腺癌SPC-A1裸鼠模型的抗肿瘤作用 | 第85-88页 |
| ·ZS-TRAIL、TRAIL样品对荷瘤模型动物肝功能生化指标的影响 | 第88-90页 |
| ·讨论 | 第90页 |
| ·本章小结 | 第90-92页 |
| 第四章 ZS-TRAIL抗肿瘤活性优于TRAIL机理初探 | 第92-113页 |
| ·前言 | 第92页 |
| ·材料 | 第92-96页 |
| ·实验动物 | 第92页 |
| ·主要试剂 | 第92-93页 |
| ·主要溶液及缓冲液的配制 | 第93-95页 |
| ·主要仪器 | 第95-96页 |
| ·方法 | 第96-99页 |
| ·透析 | 第96页 |
| ·圆二色谱法分析Tm值 | 第96页 |
| ·SEC-HPLC测寡聚化状态 | 第96页 |
| ·交联测寡聚化状态 | 第96-97页 |
| ·SDS-PAGE快速银染 | 第97页 |
| ·非还原SDS-PAGE分析 | 第97-98页 |
| ·药物代谢动力学研究—双抗体夹心ELISA法 | 第98-99页 |
| ·37℃、4℃条件下稳定性比较实验 | 第99页 |
| ·人血白蛋白(HSA)对TRAIL及ZS-TRAIL稳定性影响 | 第99页 |
| ·火焰原子吸收光谱法测锌离子含量 | 第99页 |
| ·数据分析 | 第99页 |
| ·结果 | 第99-108页 |
| ·ZS-TRAIL和TRAIL寡聚化状态比较 | 第99-103页 |
| ·SEC-HPLC | 第99-100页 |
| ·交联 | 第100-102页 |
| ·非还原SDS-PAGE电泳 | 第102页 |
| ·Zn~(2+)含量的比较 | 第102-103页 |
| ·ZS-TRAIL和TRAIL稳定性比较 | 第103-107页 |
| ·热稳定性比较(Tm值) | 第103-104页 |
| ·贴近生理条件下(37℃)TRAIL和ZS-TRAIL稳定性比较实验 | 第104-105页 |
| ·4℃条件下TRAIL和ZS-TRAIL稳定性比较实验 | 第105-107页 |
| ·人血白蛋白对TRAIL和ZS-TRAIL稳定性影响 | 第107页 |
| ·ZS-TRAIL和TRAIL半衰期比较 | 第107-108页 |
| ·讨论 | 第108-111页 |
| ·本章小结 | 第111-113页 |
| 第五章 ZS-TRAIL表达条件的优化 | 第113-132页 |
| ·前言 | 第113-114页 |
| ·材料 | 第114-115页 |
| ·试剂 | 第114页 |
| ·培养基及培养条件 | 第114-115页 |
| ·主要仪器 | 第115页 |
| ·实验方法 | 第115-119页 |
| ·响应面法确定ZS-TRAIL最佳可溶性表达条件 | 第115-117页 |
| ·Plackett-Burman设计 | 第115-116页 |
| ·最陡坡实验设计 | 第116-117页 |
| ·中心组合实验设计 | 第117页 |
| ·验证实验 | 第117页 |
| ·高密度发酵 | 第117-118页 |
| ·发酵参数 | 第117-118页 |
| ·pH-stat分批补料发酵方法 | 第118页 |
| ·目的蛋白的分离纯化 | 第118页 |
| ·数据测定和分析方法 | 第118-119页 |
| ·细胞密度0D_(600)测定方法 | 第118页 |
| ·细胞干重测定方法 | 第118页 |
| ·蛋白浓度的测定 | 第118-119页 |
| ·数据分析 | 第119页 |
| ·结果 | 第119-129页 |
| ·Plackett-Burman实验结果 | 第119-122页 |
| ·最陡坡试验结果 | 第122-123页 |
| ·中心组合实验和响应面分析 | 第123-126页 |
| ·最佳培养条件的验证实验 | 第126-127页 |
| ·高密度发酵 | 第127-128页 |
| ·目的蛋白的分离纯化 | 第128-129页 |
| ·讨论 | 第129-131页 |
| ·响应面法优化表达条件 | 第129-130页 |
| ·高密度发酵 | 第130-131页 |
| ·本章小结 | 第131-132页 |
| 第六章 全文总结及后续工作建议 | 第132-134页 |
| ·全文总结 | 第132-133页 |
| ·本文创新点 | 第133页 |
| ·后续工作建议 | 第133-134页 |
| 参考文献 | 第134-142页 |
| 作者简历 | 第142页 |
