| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-17页 |
| 引言 | 第17-37页 |
| 1. RSV 的生物学特性和流行病学 | 第17-20页 |
| 2. RSV 感染的免疫病理 | 第20-21页 |
| 3. RSV 感染的治疗 | 第21-23页 |
| 4. 预防 RSV 感染的疫苗研究 | 第23-33页 |
| ·福尔马林灭活疫苗 | 第25页 |
| ·亚单位疫苗 | 第25-29页 |
| ·减毒活疫苗 | 第29-31页 |
| ·病毒载体疫苗 | 第31-32页 |
| ·基因工程疫苗 | 第32页 |
| ·核酸疫苗 | 第32-33页 |
| 5. 杆状病毒表达系统 | 第33-35页 |
| ·杆状病毒的生物学特性 | 第33页 |
| ·杆状病毒表达系统组成 | 第33-35页 |
| ·供体质粒 | 第33-34页 |
| ·穿梭载体质粒 | 第34页 |
| ·昆虫细胞 | 第34-35页 |
| ·杆状病毒昆虫表达系统的原理 | 第35页 |
| ·杆状病毒昆虫表达系统技术路线 | 第35页 |
| 6. 本研究的目的和意义 | 第35-37页 |
| 第一章 RSV F 和 G 全长蛋白疫苗的质粒构建、表达和纯化 | 第37-60页 |
| 1. 材料 | 第37-40页 |
| ·毒株和细胞 | 第37页 |
| ·主要药品与试剂 | 第37-38页 |
| ·引物设计 | 第38页 |
| ·试验仪器 | 第38页 |
| ·溶液的配置 | 第38-40页 |
| ·主要缓冲液 | 第38-39页 |
| ·培养基 | 第39-40页 |
| ·分子生物学分析软件 | 第40页 |
| 2. 方法 | 第40-50页 |
| ·呼吸道合胞病毒的培养 | 第40-41页 |
| ·培养 Vero 细胞 | 第40页 |
| ·Vero 细胞复苏 | 第40页 |
| ·Vero 细胞的继代培养 | 第40页 |
| ·细胞准备 | 第40页 |
| ·培养 RSV | 第40-41页 |
| ·总提 RSV 病毒 RNA | 第41页 |
| ·准备 | 第41页 |
| ·总提 RNA | 第41页 |
| ·RT-PCR | 第41-42页 |
| ·反转录 | 第41页 |
| ·PCR | 第41-42页 |
| ·琼脂糖凝胶电泳 | 第42页 |
| ·目的片段与 T 载体的连接 | 第42-43页 |
| ·目的片段的胶回收纯化 | 第42页 |
| ·回收 PCR 产物分别与 T 载体连接 | 第42页 |
| ·连接产物的转化 | 第42页 |
| ·重组质粒的鉴定 | 第42-43页 |
| ·重组质粒的 PCR 扩增鉴定 | 第42-43页 |
| ·重组质粒的酶切鉴定 | 第43页 |
| ·重组质粒的测序 | 第43页 |
| ·目的片段与表达载体连接 | 第43-45页 |
| ·目的片段酶切回收纯化 | 第43页 |
| ·载体质粒的酶切回收 | 第43页 |
| ·目的片段与表达载体的连接 | 第43-44页 |
| ·连接产物的转化 | 第44页 |
| ·重组质粒的鉴定 | 第44-45页 |
| ·重组质粒的 PCR 扩增鉴定 | 第44页 |
| ·重组质粒的酶切鉴定 | 第44-45页 |
| ·重组质粒的测序 | 第45页 |
| ·阳性质粒的同源重组 | 第45页 |
| ·同源重组质粒的菌落 PCR 鉴定 | 第45-46页 |
| ·分离重组质粒 F-Bacmid 和 G-Bacmid DNA | 第46页 |
| ·分析重组质粒 Bacmid DNA | 第46-47页 |
| ·用琼脂糖凝胶电泳分析重组质粒 DNA | 第46页 |
| ·用 PCR 分析重组质粒 Bacmid DNA | 第46-47页 |
| ·Sf9 昆虫细胞培养 | 第47页 |
| ·Sf9 昆虫细胞的复苏 | 第47页 |
| ·Sf9 昆虫细胞的传代 | 第47页 |
| ·昆虫细胞的冻存 | 第47页 |
| ·细胞转染 | 第47-48页 |
| ·收获重组杆状病毒 | 第48页 |
| ·PCR 鉴定重组杆状病毒 | 第48页 |
| ·空斑试验测定病毒效价 | 第48页 |
| ·重组杆状病毒的扩增 | 第48页 |
| ·重组蛋白的表达 | 第48-49页 |
| ·重组蛋白表达的检测 | 第49页 |
| ·SDS-PAGE | 第49页 |
| ·间接免疫荧光法检测表达蛋白 | 第49页 |
| ·重组蛋白的 Western-blot 检测 | 第49页 |
| ·Ni~(2+)亲和层析法纯化目的蛋白 | 第49-50页 |
| 3. 结果 | 第50-58页 |
| ·Vero 细胞培养 RSV Long 的细胞病变 | 第50页 |
| ·RT-PCR 扩增 F 和 G 基因片段的电泳结果 | 第50-51页 |
| ·目的片段连 T 载体菌落 PCR 和酶切鉴定结果 | 第51-52页 |
| ·目的片段与pFastHT A 载体连接菌落 PCR 和酶切鉴定结果 | 第52-53页 |
| ·同源重组菌落 PCR 结果 | 第53页 |
| ·分析重组质粒 Bacmid DNA 结果 | 第53-54页 |
| ·转染 Sf9 细胞结果 | 第54-55页 |
| ·空斑试验结果 | 第55-56页 |
| ·蛋白表达结果 | 第56-57页 |
| ·Ni~(2+)亲和层析纯化目的蛋白结果 | 第57-58页 |
| 4. 小结与讨论 | 第58-60页 |
| 第二章 RSV F 和 G 全长蛋白疫苗免疫效果的研究 | 第60-82页 |
| 1. 材料 | 第60-61页 |
| ·毒株和细胞 | 第60页 |
| ·主要试剂与仪器 | 第60页 |
| ·实验动物 | 第60页 |
| ·主要试剂的配制 | 第60-61页 |
| 2. 方法 | 第61-64页 |
| ·RSV A 型 Long 株病毒的培养 | 第61页 |
| ·RSV Long 病毒滴度测定 | 第61页 |
| ·纯化的 F、G 蛋白候选疫苗免疫动物 | 第61-62页 |
| ·配制 F、F/Mf59、F/弗氏佐剂重组蛋白疫苗免疫动物 | 第61-62页 |
| ·配制 G、G/Mf59、G/弗氏佐剂重组蛋白疫苗免疫动物 | 第62页 |
| ·免疫鼠血清特异性 IgG 抗体效价检测 | 第62页 |
| ·免疫鼠肺、鼻灌洗液特异性 IgG 和 SIgA 检测 | 第62-63页 |
| ·免疫鼠肺灌洗液的制备 | 第62页 |
| ·免疫鼠鼻灌洗液的制备 | 第62-63页 |
| ·免疫鼠肺、鼻灌洗液特异性 IgG 检测 | 第63页 |
| ·免疫鼠肺、鼻灌洗液特异性 SIgA 检测 | 第63页 |
| ·免疫鼠血清特异性 IgG1 和 IgG2a 检测 | 第63页 |
| ·免疫鼠血清中和抗体滴度检测 | 第63页 |
| ·脾脏淋巴细胞制悬液备 | 第63-64页 |
| ·免疫鼠 T 淋巴细胞增殖检测 | 第64页 |
| ·脾脏细胞γ-IFN、IL-2、IL-4 分泌的检测 | 第64页 |
| ·数据处理 | 第64页 |
| 3. 结果 | 第64-77页 |
| ·RSV 病毒滴度 | 第64-65页 |
| ·免疫鼠血清抗体效价 | 第65-67页 |
| ·免疫鼠肺、鼻灌洗液 IgG 抗体效价 | 第67-68页 |
| ·免疫鼠肺、鼻灌洗液 SIgA 抗体效价 | 第68-70页 |
| ·免疫鼠血清特异性 IgG1 和 IgG2a 效价 | 第70-72页 |
| ·免疫鼠血清中和抗体滴度 | 第72页 |
| ·免疫鼠 T 淋巴细胞增殖检测结果 | 第72-73页 |
| ·免疫鼠脾脏分泌γ-IFN、IL-2、IL-4 的淋巴细胞数 | 第73-77页 |
| ·免疫鼠脾脏分泌γ-IFN 的淋巴细胞数 | 第73-75页 |
| ·免疫鼠脾脏分泌 IL-2 的淋巴细胞数 | 第75-76页 |
| ·免疫鼠脾脏分泌 IL-4 淋巴细胞数 | 第76-77页 |
| 4. 小结与讨论 | 第77-82页 |
| ·体液免疫效果评价 | 第78-79页 |
| ·细胞免疫效果评价 | 第79-80页 |
| ·黏膜免疫效果评价 | 第80-82页 |
| 第三章 RSV F-G 蛋白表位肽疫苗的质粒构建、表达及纯化 | 第82-93页 |
| 1. 材料 | 第83页 |
| ·生物信息学软件预测 F 和 G 蛋白表位 | 第83页 |
| ·F 和 G 蛋白表位基因序列的合成 | 第83页 |
| ·质粒 | 第83页 |
| ·引物设计 | 第83页 |
| 2. 方法 | 第83-84页 |
| ·PCR 扩增 F 和 G 串联表位基因 | 第83-84页 |
| ·重叠 PCR 扩增 F-G 串联表位基因 | 第84页 |
| ·重组质粒 F-G-T、F-G-pFastHT A 的酶切鉴定 | 第84页 |
| 3. 结果 | 第84-90页 |
| ·PCR 扩增 F 串联表位基因和 G 片段串联表位基因电泳结果 | 第84-85页 |
| ·重叠 PCR 扩增 F-G 串联表位基因的电泳结果 | 第85页 |
| ·F-G 串联表位基因连 T 载体菌落 PCR 和双酶切结果 | 第85-86页 |
| ·F-G 串联表位基因与pFastHT A 连切接菌落 PCR 和双酶切结果 | 第86页 |
| ·同源重组菌落 PCR 结果 | 第86页 |
| ·分析重组质粒 Bacmid DNA 结果 | 第86-87页 |
| ·转染 Sf9 细胞结果 | 第87-88页 |
| ·空斑试验结果 | 第88页 |
| ·蛋白表达结果 | 第88-89页 |
| ·目的蛋白纯化结果 | 第89-90页 |
| 4. 小结与与讨论 | 第90-93页 |
| 全文讨论 | 第93-96页 |
| 结论 | 第96-97页 |
| 致谢 | 第97-98页 |
| 参考文献 | 第98-108页 |
| 作者简介 | 第108页 |
