| 摘要 | 第3-5页 |
| abstract | 第5-6页 |
| 第1章 前言 | 第14-24页 |
| 1.1 植物病毒危害和防治方法 | 第14-15页 |
| 1.2 蛋白质类植物病毒抑制剂研究状况及机制 | 第15-18页 |
| 1.2.1 抗病毒蛋白对核糖体脱嘌呤作用 | 第15-16页 |
| 1.2.2 抗病毒蛋白与病毒rRNA的结合脱嘌呤作用 | 第16页 |
| 1.2.3 抗病毒蛋白对病毒带有帽结构的mRNA模板的脱嘌呤作用 | 第16页 |
| 1.2.4 抗病毒蛋白诱导植物病程相关蛋白的表达 | 第16页 |
| 1.2.5 抗病毒蛋白特异地抑制与病毒复制有关的蛋白酶 | 第16-17页 |
| 1.2.6 抗病毒蛋白诱导其它蛋白或物质的产生使植株产生系统抗性 | 第17-18页 |
| 1.3 植物抗病毒蛋白诱导剂的局限性及其发展方向 | 第18-19页 |
| 1.4 真核表达的原理及优点 | 第19-20页 |
| 1.4.1 真核表达的原理 | 第19-20页 |
| 1.4.2 真核表达系统的优势 | 第20页 |
| 1.5 Y3蛋白的研究进展 | 第20-21页 |
| 1.6 研究内容与意义 | 第21-24页 |
| 1.6.1 研究内容 | 第21-22页 |
| 1.6.2 研究意义 | 第22-24页 |
| 第2章 真核载体的构建 | 第24-42页 |
| 2.1 试验材料 | 第24-27页 |
| 2.1.1 主要材料 | 第24页 |
| 2.1.2 载体图谱 | 第24-25页 |
| 2.1.2.1 pUC-T载体图谱 | 第24-25页 |
| 2.1.2.2 pPIC-9k载体图谱 | 第25页 |
| 2.1.3 主要试剂及试剂盒 | 第25页 |
| 2.1.4 主要仪器与设备 | 第25-26页 |
| 2.1.5 所使用的生物信息软件和网络资源 | 第26页 |
| 2.1.6 主要试剂和培养基的配制 | 第26-27页 |
| 2.1.6.1 大肠杆菌感受态细胞制备所用试剂 | 第26页 |
| 2.1.6.2 琼脂糖凝胶电泳母液所用试剂 | 第26页 |
| 2.1.6.3 培养基的配制 | 第26-27页 |
| 2.2 试验方法 | 第27-34页 |
| 2.2.1 y3基因cDNA序列扩增引物的设计 | 第27页 |
| 2.2.2 毛头鬼伞总RNA的提取 | 第27页 |
| 2.2.3 PCR扩增蛋白y3基因cDNA序列 | 第27-29页 |
| 2.2.3.1 Y3蛋白基因cDNA第一条链的合成 | 第27-28页 |
| 2.2.3.2 Y3蛋白基因cDNA序列的PCR扩增 | 第28-29页 |
| 2.2.3.3 Y3目的基因PCR产物的纯化 | 第29页 |
| 2.2.3.4 Y3蛋白基因cDNA片段尾端加A | 第29页 |
| 2.2.4 重组载体pUC-T-y3的构建 | 第29-31页 |
| 2.2.4.1 y3基因cDNA序列克隆载体的构建 | 第29-30页 |
| 2.2.4.2 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备与转化 | 第30页 |
| 2.2.4.2.1 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备(CaCl2法) | 第30页 |
| 2.2.4.2.2 大肠杆菌DH5α感受态细胞的转化 | 第30页 |
| 2.2.4.3 重组质粒pUC-T-y3的PCR鉴定 | 第30-31页 |
| 2.2.4.4 基因克隆产物的序列测定 | 第31页 |
| 2.2.4.5 y3基因cDNA序列的分析 | 第31页 |
| 2.2.5 重组质粒pPIC-9k-y3的构建 | 第31-34页 |
| 2.2.5.1 重组质粒的提取 | 第31页 |
| 2.2.5.2 质粒pPIC-9k的转化和提取 | 第31-32页 |
| 2.2.5.2.1 质粒pPIC-9k的转化 | 第31页 |
| 2.2.5.2.2 质粒pPIC-9k的提取 | 第31-32页 |
| 2.2.5.2.3 提取质粒pPIC-9k的电泳检测 | 第32页 |
| 2.2.5.3 重组质粒pUC-T-y3与质粒pPIC-9k的双酶切 | 第32页 |
| 2.2.5.4 双酶切产物的纯化和酶连接反应 | 第32-33页 |
| 2.2.5.4.1 重组质粒pUC-T-y3和质粒pPIC-9k的纯化 | 第32页 |
| 2.2.5.4.2 y3cDNA片段和质粒pPIC-9k的酶连 | 第32-33页 |
| 2.2.5.5 大肠杆菌DH5α感受态细胞的转化 | 第33页 |
| 2.2.5.6 重组质粒的PCR鉴定 | 第33页 |
| 2.2.5.7 重组质粒的双酶切验证 | 第33-34页 |
| 2.2.5.7.1 重组质粒pPIC-9k-y3的提取 | 第33-34页 |
| 2.2.5.7.2 双酶切验证 | 第34页 |
| 2.2.5.8 Y3蛋白基因cDNA序列的测定和分析 | 第34页 |
| 2.3 结果与分析 | 第34-40页 |
| 2.3.1 毛头鬼伞总RNA的提取 | 第34-35页 |
| 2.3.2 Y3蛋白cDNA序列RT-PCR扩增结果 | 第35页 |
| 2.3.3 重组质粒pUC-T-y3的菌液PCR鉴定 | 第35-36页 |
| 2.3.4 Y3蛋白cDNA序列测定结果 | 第36-37页 |
| 2.3.5 质粒pPIC-9k的提取 | 第37页 |
| 2.3.6 重组质粒pPIC-9k-y3的PCR鉴定 | 第37-38页 |
| 2.3.7 重组载体pPIC-9k-y3的鉴定 | 第38-39页 |
| 2.3.8 y3基因cDNA序列测定结果 | 第39-40页 |
| 本章小结与讨论 | 第40-42页 |
| 第3章 毕赤酵母真核表达系统的构建 | 第42-56页 |
| 3.1 试验材料 | 第42-44页 |
| 3.1.1 试验菌种和载体 | 第42页 |
| 3.1.2 主要试剂及试剂盒 | 第42页 |
| 3.1.3 主要仪器与设备 | 第42页 |
| 3.1.4 主要试剂和培养基的配制 | 第42-44页 |
| 3.1.4.1 培养基试剂的配制 | 第42-43页 |
| 3.1.4.2 毕赤酵母GS115感受态细胞制备所用试剂 | 第43页 |
| 3.1.4.3 菌落PCR所用试剂 | 第43页 |
| 3.1.4.4 培养基的配制 | 第43-44页 |
| 3.2 试验方法 | 第44-48页 |
| 3.2.1 引物设计 | 第44页 |
| 3.2.2 重组质粒pPIC-9k-y3和空质粒pPIC-9k的提取 | 第44-45页 |
| 3.2.3 重组质粒pPIC-9k-y3和空质粒pPIC-9k的线性化 | 第45页 |
| 3.2.4 线性质粒pPIC-9k-y3和pPIC-9k的纯化 | 第45页 |
| 3.2.5 酵母感受态细胞的制备和转化 | 第45-46页 |
| 3.2.5.1 毕赤酵母GS115感受态细胞的制备(电转法) | 第45-46页 |
| 3.2.5.2 毕赤酵母GS115感受态细胞的转化 | 第46页 |
| 3.2.6 Muts表型高拷贝型阳性转化子的筛选 | 第46-48页 |
| 3.2.6.1 MD与MM平板对比生长试验 | 第46-47页 |
| 3.2.6.2 Geneticin(G418)筛选高拷贝型转化子 | 第47页 |
| 3.2.6.3 菌落PCR筛选阳性转化子 | 第47-48页 |
| 3.3 结果与分析 | 第48-54页 |
| 3.3.1 重组质粒pPIC-9k-y3和质粒pPIC-9k | 第48-49页 |
| 3.3.2 重组质粒pPIC-9k-y3与质粒pPIC-9k的线性化 | 第49-50页 |
| 3.3.3 Muts表型高拷贝型阳性转化子的筛选 | 第50-53页 |
| 3.3.3.1 MD与MM平板对比生长试验 | 第50-51页 |
| 3.3.2.2 筛选His+Muts高拷贝型菌株 | 第51-52页 |
| 3.3.3.3 菌落PCR筛选重组质粒pPIC-9k-y3阳性转化子 | 第52-53页 |
| 3.3.4 菌落PCR筛选质粒pPIC-9k阳性转化子 | 第53-54页 |
| 本章小结与讨论 | 第54-56页 |
| 第4章 Y3蛋白的诱导表达与鉴定 | 第56-62页 |
| 4.1 试验材料 | 第56-57页 |
| 4.1.1 主要试剂及试剂盒 | 第56页 |
| 4.1.2 主要仪器与设备 | 第56页 |
| 4.1.3 主要试剂和培养基的配制 | 第56-57页 |
| 4.1.3.1 试剂的配制 | 第56-57页 |
| 4.1.3.2 培养基的配制 | 第57页 |
| 4.2 试验方法 | 第57-58页 |
| 4.2.1 Y3蛋白的诱导表达 | 第57页 |
| 4.2.2 SDS-PAGE电泳鉴定目的蛋白 | 第57页 |
| 4.2.3 Westernblot鉴定目的蛋白 | 第57-58页 |
| 4.3 结果与分析 | 第58-61页 |
| 4.3.1 Y3蛋白的诱导表达 | 第58-59页 |
| 4.3.2 SDS-PAGE电泳鉴定目的蛋白 | 第59页 |
| 4.3.3 Westernblot鉴定目的蛋白 | 第59-61页 |
| 本章小结与讨论 | 第61-62页 |
| 第5章 Y3蛋白诱导烟草系统获得抗病性的生化机制 | 第62-81页 |
| 5.1 试验材料 | 第62-63页 |
| 5.1.1 主要试剂及试剂盒 | 第62页 |
| 5.1.2 主要仪器与设备 | 第62页 |
| 5.1.3 试剂的配制 | 第62-63页 |
| 5.2 试验方法 | 第63-66页 |
| 5.2.1 摩擦接种烟草花叶病毒 | 第63页 |
| 5.2.2 试验烟草预处理 | 第63-64页 |
| 5.2.2.1 健康烟草喷施Y3蛋白试验处理 | 第63页 |
| 5.2.2.2 染病烟草喷施Y3蛋白试验处理 | 第63-64页 |
| 5.2.2.3 健康烟草喷施Y3蛋白后接种TMV试验处理 | 第64页 |
| 5.2.3 酶活测定 | 第64-66页 |
| 5.2.3.1 过氧化物酶活性测定 | 第64页 |
| 5.2.3.2 BCA法测定总蛋白 | 第64-65页 |
| 5.2.3.3 多酚氧化酶活性测定 | 第65页 |
| 5.2.3.4 几丁质酶活性测定 | 第65页 |
| 5.2.3.5 苯丙氨酸解氨酶活性测定 | 第65页 |
| 5.2.3.6 β-1,3葡聚糖酶活性测定 | 第65-66页 |
| 5.3 结果与分析 | 第66-79页 |
| 5.3.1 Y3蛋白对健康烟草酶活影响 | 第66-70页 |
| 5.3.1.1 过氧化物酶活性变化 | 第66-67页 |
| 5.3.1.2 多酚氧化酶活性变化 | 第67页 |
| 5.3.1.3 几丁质酶活性变化 | 第67-68页 |
| 5.3.1.4 苯丙氨酸解氨酶活性变化 | 第68-69页 |
| 5.3.1.5 β-1,3葡聚糖酶活性变化 | 第69-70页 |
| 5.3.2 Y3蛋白对染病烟草酶活影响 | 第70-74页 |
| 5.3.2.1 过氧化物酶活性变化 | 第70-71页 |
| 5.3.2.2 多酚氧化酶活性变化 | 第71-72页 |
| 5.3.2.3 几丁质酶活性变化 | 第72页 |
| 5.3.2.4 苯丙氨酸解氨酶活性变化 | 第72-73页 |
| 5.3.2.5 β-1,3葡聚糖酶活性变化 | 第73-74页 |
| 5.3.3 Y3蛋白对TMV侵染烟草时烟草体内酶活影响 | 第74-79页 |
| 5.3.3.1 过氧化物酶活性变化 | 第74页 |
| 5.3.3.2 多酚氧化酶活性变化 | 第74-75页 |
| 5.3.3.3 几丁质酶活性变化 | 第75-76页 |
| 5.3.3.4 苯丙氨酸解氨酶活性变化 | 第76-77页 |
| 5.3.3.5 β-1,3葡聚糖酶活性变化 | 第77-79页 |
| 本章小结与讨论 | 第79-81页 |
| 第6章 实时荧光定量PCR检测烟草抗病相关基因的表达情况 | 第81-96页 |
| 6.1 试验材料 | 第81页 |
| 6.1.1 主要材料 | 第81页 |
| 6.1.2 主要试剂及试剂盒 | 第81页 |
| 6.1.3 主要设备及仪器 | 第81页 |
| 6.2 试验方法 | 第81-83页 |
| 6.2.1 引物设计 | 第81-82页 |
| 6.2.2 普通RT-PCR扩增检测引物的特异性 | 第82页 |
| 6.2.3 荧光定量PCR分析抗病相关基因转录水平 | 第82-83页 |
| 6.3 结果与分析 | 第83-94页 |
| 6.3.1 烟草总RNA的提取 | 第83-84页 |
| 6.3.2 普通RT-PCR扩增检测引物的特异性 | 第84页 |
| 6.3.3 荧光定量PCR分析抗病相关基因转录水平 | 第84-85页 |
| 6.3.4 Y3蛋白对健康烟草相关抗病基因的影响 | 第85-88页 |
| 6.3.4.1 Y3蛋白对PR1-a基因表达量的影响 | 第85-86页 |
| 6.3.4.2 Y3蛋白对PR1-b基因表达量的影响 | 第86页 |
| 6.3.4.3 Y3蛋白对NPR1基因表达量的影响 | 第86-87页 |
| 6.3.4.4 Y3蛋白对PAL基因表达量的影响 | 第87-88页 |
| 6.3.5 Y3蛋白对染病烟草相关抗病基因的影响 | 第88-91页 |
| 6.3.5.1 Y3蛋白对PR1-a基因表达量的影响 | 第88页 |
| 6.3.5.2 Y3蛋白对PR1-b基因表达量的影响 | 第88-89页 |
| 6.3.5.3 Y3蛋白对NPR1基因表达量的影响 | 第89-90页 |
| 6.3.5.4 Y3蛋白对PAL基因表达量的影响 | 第90-91页 |
| 6.3.6 Y3蛋白对TMV侵染烟草时相关抗病基因的影响 | 第91-94页 |
| 6.3.6.1 Y3蛋白对PR1-a基因表达量的影响 | 第91页 |
| 6.3.6.2 Y3蛋白对PR1-b基因表达量的影响 | 第91-92页 |
| 6.3.6.3 Y3蛋白对NPR1基因表达量的影响 | 第92-93页 |
| 6.3.6.4 Y3蛋白对PAL基因表达量的影响 | 第93-94页 |
| 本章小结与讨论 | 第94-96页 |
| 结论与展望 | 第96-98页 |
| 致谢 | 第98-99页 |
| 参考文献 | 第99-103页 |
