| 摘要 | 第11-16页 |
| Abstract | 第16-21页 |
| 第一部分 MiR-34a 及其靶基因 SIRT1 在乳腺癌干细胞中的表达 | 第22-42页 |
| 前言 | 第22-23页 |
| 材料和方法 | 第23-32页 |
| 1. 材料 | 第23-26页 |
| 1.1 细胞株 | 第23页 |
| 1.2 主要实验仪器及器材 | 第23-24页 |
| 1.3 主要实验试剂 | 第24-26页 |
| 1.4 主要试剂的配置 | 第26页 |
| 2. 方法 | 第26-32页 |
| 2.1 常规细胞培养及乳腺球培养 | 第26-27页 |
| 2.2 流式细胞仪分选 CD44+/CD24-细胞群 | 第27页 |
| 2.3 免疫磁珠分选 CD44+/CD24-细胞群 | 第27-28页 |
| 2.4 细胞RNA的提取 | 第28页 |
| 2.5 Taqman探针法miRNA qRT-PCR | 第28-30页 |
| 2.6 SYBR Green 染料法qRT-PCR步骤 | 第30-31页 |
| 2.7 细胞蛋白提取及定量 | 第31页 |
| 2.8 免疫印迹 Western blotting 步骤 | 第31-32页 |
| 2.9 免疫荧光细胞化学 | 第32页 |
| 2.10 乳腺球形成试验 | 第32页 |
| 3. 统计学处理 | 第32页 |
| 结果 | 第32-35页 |
| 1. 流式细胞仪与免疫磁珠分选乳腺癌干细胞 | 第32-33页 |
| 2. MiR-34a在乳腺癌干细胞中低表达 | 第33页 |
| 3. SIRT1在乳腺癌干细胞中高表达 | 第33-35页 |
| 讨论 | 第35-37页 |
| 结论 | 第37-38页 |
| 参考文献 | 第38-42页 |
| 第二部分 MiR-34a 靶向调控 SIRT1 基因的表达研究 | 第42-62页 |
| 前言 | 第42-43页 |
| 材料和方法 | 第43-52页 |
| 1. 材料 | 第43-46页 |
| 1.1 质粒、病毒及细胞系 | 第43页 |
| 1.2 主要实验仪器及器材 | 第43-44页 |
| 1.3 主要实验试剂 | 第44-46页 |
| 2. 方法 | 第46-52页 |
| 2.1 MCF-7 细胞培养 | 第46页 |
| 2.2 MiR-34a mimics和inhibitors转染MCF-7细胞 | 第46页 |
| 2.3 稳定表达miR-34a的慢病毒载体的构建 | 第46-47页 |
| 2.4 MiR-34a慢病毒载体感染MCF-7细胞 | 第47-48页 |
| 2.5 shRNA-SIRT1 表达载体的构建 | 第48-51页 |
| 2.6 ShRNA-SIRT1载体转染MCF-7细胞 | 第51-52页 |
| 2.7 细胞RNA和蛋白的提取及定量 | 第52页 |
| 2.8 qRT-PCR检测miR-34a和SIRT1表达 | 第52页 |
| 2.9 Western blotting检测SIRT1蛋白表达 | 第52页 |
| 3. 统计学处理 | 第52页 |
| 结果 | 第52-56页 |
| 1. MiR-34a的mimics及inhibitors的转染效率 | 第52-53页 |
| 2. MiR-34a慢病毒表达载体感染MCF-7细胞 | 第53页 |
| 3. ShRNA-SIRT1 载体转染 MCF-7 细胞 | 第53-55页 |
| 4. MiR-34a水平的变化影响SIRT1蛋白的表达 | 第55-56页 |
| 讨论 | 第56-58页 |
| 结论 | 第58-59页 |
| 参考文献 | 第59-62页 |
| 第三部分 MiR-34a 对乳腺癌 MCF-7 细胞裸鼠移植瘤生长的抑制作用 | 第62-72页 |
| 前言 | 第62页 |
| 材料和方法 | 第62-66页 |
| 1. 材料 | 第62-63页 |
| 1.1 细胞系及实验动物 | 第62页 |
| 1.2 主要实验仪器及器材 | 第62-63页 |
| 1.3 主要实验试剂 | 第63页 |
| 2. 方法 | 第63-66页 |
| 2.1 细胞培养 | 第63页 |
| 2.2 裸鼠移植瘤模型的建立 | 第63-64页 |
| 2.3 HE染色 | 第64页 |
| 2.4 免疫组织化学染色步骤 | 第64-65页 |
| 2.5 qRT-PCR方法检测乳腺癌移植瘤miR-34a的表达 | 第65页 |
| 2.6 Western blotting 分析相关蛋白的表达 | 第65-66页 |
| 3. 统计学处理 | 第66页 |
| 结果 | 第66-68页 |
| 1. MiR-34a和SIRT1对裸鼠乳腺癌移植瘤生长的影响 | 第66页 |
| 2. 移植瘤HE 染色观察 | 第66页 |
| 3. 免疫组织化学检测移植瘤中SIRT1和ALDH1的表达 | 第66页 |
| 4. qRT-PCR检测miR-34a在移植瘤中的表达 | 第66页 |
| 5. Western blotting 检测 SIRT1 和 ALDH1 蛋白的表达 | 第66-68页 |
| 讨论 | 第68-70页 |
| 结论 | 第70-71页 |
| 参考文献 | 第71-72页 |
| 第四部分 MiR-34a 抑制乳腺癌干细胞的机制研究 | 第72-93页 |
| 前言 | 第72-73页 |
| 材料和方法 | 第73-77页 |
| 1. 材料 | 第73-75页 |
| 1.1 主要实验仪器及器材 | 第73-74页 |
| 1.2 主要实验试剂 | 第74-75页 |
| 2. 方法 | 第75-77页 |
| 2.1 CCK8法检测miR-34a对MCF-7细胞增殖的影响 | 第75页 |
| 2.2 克隆形成试验 | 第75-76页 |
| 2.3 Transwell 小室细胞迁移试验 | 第76页 |
| 2.4 Transwell细胞侵袭试验 | 第76页 |
| 2.5 流式细胞仪检测细胞的凋亡 | 第76页 |
| 2.6 流式细胞仪检测 CD44+/CD24-细胞比例 | 第76-77页 |
| 2.7 乳腺球形成试验 | 第77页 |
| 2.8 Hochest.33342/PI 染色检测细胞凋亡 | 第77页 |
| 2.9 Western blotting及免疫荧光细胞化学 | 第77页 |
| 3. 统计学处理 | 第77页 |
| 结果 | 第77-82页 |
| 1. 转染miR-34a mimics和inhibitors对细胞增殖的影响 | 第77-79页 |
| 2. 转染 miR-34a mimics 和 inhibitors 对细胞迁移、侵袭能力的影响 | 第79页 |
| 3. MiR-34a对CD44+/CD24-乳腺癌干细胞的抑制作用 | 第79-80页 |
| 4. MiR-34a促进MCF-7细胞凋亡 | 第80-82页 |
| 讨论 | 第82-87页 |
| 结论 | 第87-88页 |
| 参考文献 | 第88-93页 |
| 综述 | 第93-108页 |
| 参考文献 | 第103-108页 |
| 攻读学位期间发表论文情况 | 第108-109页 |
| 致谢 | 第109-110页 |
