| 摘要 | 第5-7页 |
| Abstract | 第7-8页 |
| 主要符号 | 第14-16页 |
| 第1章 绪论 | 第16-28页 |
| 1.1 玉米赤霉烯酮ZEN | 第16-20页 |
| 1.1.1 化学结构及性质 | 第16-17页 |
| 1.1.2 毒害作用 | 第17-18页 |
| 1.1.3 污染范围 | 第18-19页 |
| 1.1.4 在食品和饲料中的限量 | 第19页 |
| 1.1.5 检测方法 | 第19-20页 |
| 1.2 玉米赤霉烯酮的脱毒 | 第20-23页 |
| 1.2.1 物理方法 | 第20-21页 |
| 1.2.2 化学方法 | 第21页 |
| 1.2.3 生物方法 | 第21-23页 |
| 1.3 毕赤酵母表达系统 | 第23-24页 |
| 1.4 提高外源蛋白在毕赤酵母中表达量的策略 | 第24-26页 |
| 1.4.1 目的基因优化 | 第24页 |
| 1.4.2 优化表达载体 | 第24页 |
| 1.4.3 宿主菌的选择 | 第24-25页 |
| 1.4.4 增加外源基因拷贝数 | 第25页 |
| 1.4.5 发酵条件的优化 | 第25-26页 |
| 1.5 本研究意义 | 第26-28页 |
| 第2章 材料与方法 | 第28-40页 |
| 2.1 实验材料与仪器 | 第28-32页 |
| 2.1.1 实验菌株 | 第28页 |
| 2.1.2 质粒 | 第28页 |
| 2.1.3 培养基 | 第28-29页 |
| 2.1.4 引物 | 第29页 |
| 2.1.5 主要溶液 | 第29-30页 |
| 2.1.6 酶与生化试剂 | 第30-31页 |
| 2.1.7 主要仪器设备 | 第31-32页 |
| 2.2 实验方法与步骤 | 第32-40页 |
| 2.2.1 质粒DNA的抽提 | 第32页 |
| 2.2.2 酵母总DNA的抽提 | 第32页 |
| 2.2.3 溶液回收目的DNA片段 | 第32-33页 |
| 2.2.4 琼脂糖凝胶回收目的DNA片段 | 第33页 |
| 2.2.5 常规转化步骤 | 第33页 |
| 2.2.6 菌落PCR验证重组子 | 第33页 |
| 2.2.7 毕赤酵母表达载体pPIC9K-zhd的构建与验证 | 第33-34页 |
| 2.2.8 毕赤酵母多拷贝表达载体的构建与验证 | 第34页 |
| 2.2.9 快速筛选重组子的方法 | 第34页 |
| 2.2.10 毕赤酵母电转感受态细胞的制备 | 第34-35页 |
| 2.2.11 毕赤酵母感受态细胞电转化 | 第35页 |
| 2.2.12 重组毕赤酵母摇瓶诱导表达 | 第35页 |
| 2.2.13 SDS-PAGE | 第35-36页 |
| 2.2.14 Bradford法测蛋白浓度 | 第36页 |
| 2.2.15 荧光定量PCR确定拷贝数 | 第36-37页 |
| 2.2.16 ZEN降解酶ZHD的纯化 | 第37页 |
| 2.2.17 HPLC分析ZEN | 第37页 |
| 2.2.18 ZEN降解酶ZHD酶活的测定 | 第37-38页 |
| 2.2.19 ZEN降解酶降解ZEN衍生物 | 第38页 |
| 2.2.20 重组毕赤酵母发酵罐高密度发酵 | 第38-40页 |
| 第3章 结果与分析 | 第40-56页 |
| 3.1 ZEN降解酶基因zhd密码子优化 | 第40-41页 |
| 3.2 pHBM905BDM-zhd表达载体的构建 | 第41-42页 |
| 3.3 pHBM905BDM-zhd毕赤酵母的转化 | 第42-43页 |
| 3.4 ZEN降解酶ZHD在毕赤酵母中的表达验证 | 第43-44页 |
| 3.5 pHBM905BDM-zhd多拷贝表达载体的构建 | 第44-46页 |
| 3.6 1-4拷贝pHBM905BDM-zhd在毕赤酵母中的表达 | 第46-47页 |
| 3.7 ZEN降解酶ZHD酶活的检测 | 第47-50页 |
| 3.7.1 ZEN降解酶蛋白的表达与纯化 | 第47-48页 |
| 3.7.2 ZEN标准曲线的绘制 | 第48页 |
| 3.7.3 ZEN降解酶ZHD酶活的测定 | 第48-50页 |
| 3.8 ZHD降解ZEN衍生物 | 第50页 |
| 3.9 G418筛选高拷贝 | 第50-51页 |
| 3.10 荧光定量PCR计算zhd基因的拷贝数 | 第51-52页 |
| 3.11 ZEN降解酶ZHD高密度发酵 | 第52-53页 |
| 3.12 蛋白质谱分析 | 第53-56页 |
| 第4章 讨论 | 第56-59页 |
| 4.1 ZHD的基因密码子优化 | 第56-57页 |
| 4.2 基因多拷贝策略 | 第57页 |
| 4.3 ZHD蛋白酶活测定 | 第57-58页 |
| 4.4 ZHD蛋白高密度发酵 | 第58-59页 |
| 总结 | 第59-60页 |
| 参考文献 | 第60-68页 |
| 致谢 | 第68-69页 |
| 硕士研究生期间主要成果和获奖 | 第69页 |
