| 摘要 | 第5-6页 |
| Abstract | 第6-7页 |
| 符号说明 | 第8-13页 |
| 1 文献综述 | 第13-23页 |
| 1.1 异种器官移植研究进展 | 第13-15页 |
| 1.1.1 异种器官移植的发展历程 | 第13-14页 |
| 1.1.2 猪作为异种器官移植供体的优势 | 第14页 |
| 1.1.3 猪和灵长类动物的移植免疫障碍 | 第14-15页 |
| 1.2 异种胰岛移植的研究进展 | 第15-17页 |
| 1.2.1 胰岛移植的重要性 | 第15-16页 |
| 1.2.2 胰岛移植的发展进程 | 第16页 |
| 1.2.3 胰岛移植面临的问题 | 第16-17页 |
| 1.3 LEA29Y在抗T细胞排斥反应中的研究 | 第17-19页 |
| 1.3.1 T细胞的活化增殖 | 第17-18页 |
| 1.3.2 CTLA4-Ig的研究进展 | 第18-19页 |
| 1.3.3 LEA29Y的研究进展 | 第19页 |
| 1.4 胰岛素启动子的研究进展 | 第19-20页 |
| 1.5 与本研究相关的技术及方法 | 第20-23页 |
| 1.5.1 TALENs工作原理和应用 | 第20-22页 |
| 1.5.2 绿色荧光蛋白(GFP)报告基因 | 第22-23页 |
| 2 本研究的目的及意义 | 第23-24页 |
| 2.1 研究目的 | 第23页 |
| 2.2 研究意义 | 第23-24页 |
| 3 材料与方法 | 第24-43页 |
| 3.1 试验材料 | 第24-29页 |
| 3.1.1 动物性材料 | 第24页 |
| 3.1.2 质粒与菌株 | 第24页 |
| 3.1.3 实验试剂 | 第24-25页 |
| 3.1.4 实验耗材 | 第25页 |
| 3.1.5 主要仪器设备 | 第25-26页 |
| 3.1.6 常用试剂的配制 | 第26-29页 |
| 3.2 试验方法 | 第29-43页 |
| 3.2.1 细胞系的建立及细胞培养与转染 | 第29-30页 |
| 3.2.2 PIP介导eGFP表达的载体构建与改造 | 第30-35页 |
| 3.2.3 PIP介导EGFP表达载体的特异性与活性检测 | 第35-37页 |
| 3.2.4 PIP介导LEA29Y特异性表达载体的构建及体外验证 | 第37-39页 |
| 3.2.5 GTKO/LEA29Y阳性单细胞克隆的获得 | 第39-41页 |
| 3.2.6 阳性单细胞克隆的核移植及胚胎移植 | 第41-42页 |
| 3.2.7 GTKO/LEA29Y转基因仔猪的鉴定 | 第42-43页 |
| 4 结果与分析 | 第43-54页 |
| 4.1 五指山小型猪耳成纤维细胞系的建立 | 第43页 |
| 4.2 PIP介导EGFP表达的载体构建与改造 | 第43-44页 |
| 4.2.1 五指山小型猪基因组DNA的提取结果 | 第43-44页 |
| 4.2.2 特异性表达载体无内毒素质粒的大提结果 | 第44页 |
| 4.3 PIP介导EGFP表达载体的特异性与活性检测 | 第44-48页 |
| 4.3.1 EGFP荧光的观测 | 第44-45页 |
| 4.3.2 细胞体外表达EGFP的RT-PCR半定量检测 | 第45-46页 |
| 4.3.3 细胞体外表达EGFP的western blot分析 | 第46-47页 |
| 4.3.4 细胞流式分析 | 第47-48页 |
| 4.4 PIP介导LEA29Y特异性表达载体的构建及体外验证 | 第48-50页 |
| 4.4.1 表达载体pBS-LEA29Y-bGHpA-Hyg的酶切验证 | 第48-49页 |
| 4.4.2 细胞水平的DNA及RT-PCR检测 | 第49页 |
| 4.4.3 细胞蛋白western blot检测 | 第49-50页 |
| 4.5 GTKO/LEA29Y阳性单细胞克隆的获得 | 第50-52页 |
| 4.5.1 TALEN基因效率检测 | 第50页 |
| 4.5.2 五指山小型猪耳成纤维细胞对潮霉素毒性敏感性的检测 | 第50页 |
| 4.5.3 GTKO/LEA29Y单细胞克隆的TALEN鉴定 | 第50-51页 |
| 4.5.4 GTKO/LEA29Y单细胞克隆的LEA29Y鉴定 | 第51-52页 |
| 4.6 阳性单细胞克隆的核移植及胚胎移植 | 第52页 |
| 4.7 GTKO/LEA29Y转基因仔猪的鉴定 | 第52-54页 |
| 5 讨论 | 第54-58页 |
| 5.1 五指山小型猪耳成纤维细胞系的建立 | 第54页 |
| 5.2 PIP介导EGFP表达的载体构建 | 第54-55页 |
| 5.3 PIP介导EGFP表达载体的特异性与活性检测 | 第55-56页 |
| 5.4 PIP介导LEA29Y特异性表达载体的构建及体外验证 | 第56页 |
| 5.5 GTKO/LEA29Y阳性单细胞克隆的获得 | 第56-58页 |
| 6 结论 | 第58-59页 |
| 参考文献 | 第59-64页 |
| 致谢 | 第64页 |
