| 摘要 | 第8-9页 |
| ABSTRACT | 第9-10页 |
| 文献综述 | 第12-20页 |
| 一、金属蛋白酶的研究进展 | 第12-13页 |
| 1 蛋白酶的简介 | 第12页 |
| 2 金属蛋白酶的研究概况 | 第12-13页 |
| 二、核酸酶的研究进展 | 第13-14页 |
| 三、沙雷氏菌及其胞外分泌物的研究概况 | 第14-16页 |
| 1 粘质沙雷氏菌中核酸酶的研究进展 | 第14-15页 |
| 2 粘质沙雷氏菌中金属蛋白酶的研究进展 | 第15-16页 |
| 四、多功能蛋白的研究概况 | 第16-20页 |
| 第一章 沙雷氏菌FS14中双功能酶50kD serralysin的分离纯化、三维结构解析及特性研究 | 第20-36页 |
| 1.1 实验材料 | 第20-21页 |
| 1.1.1 菌株 | 第20页 |
| 1.1.2 培养基 | 第20页 |
| 1.1.3 主要试剂 | 第20页 |
| 1.1.4 主要仪器 | 第20-21页 |
| 1.2 实验方法 | 第21-24页 |
| 1.2.1 功能酶50kD serralysin的分离纯化 | 第21-22页 |
| 1.2.2 功能酶50kD serralysin的蛋白酶特性的研究 | 第22-23页 |
| 1.2.3 功能酶50kD serralysin的DNA酶活性的研究 | 第23页 |
| 1.2.4 功能酶50kD serralysin的结晶及三维结构的解析 | 第23-24页 |
| 1.3 实验结果与分析 | 第24-34页 |
| 1.3.1 功能酶50kD serralysin的分离纯化 | 第24-26页 |
| 1.3.2 功能酶50kD serralysin的蛋白酶特性的研究 | 第26-29页 |
| 1.3.3 功能酶50kD serralysin的核酸酶活性的研究 | 第29-32页 |
| 1.3.4 功能酶50kD serralysin的结晶及三维结构的解析 | 第32-34页 |
| 1.4 讨论 | 第34-35页 |
| 1.5 小结 | 第35-36页 |
| 第二章 双功能酶50kD serralysin的基因克隆和表达及表达蛋白的纯化和特性研究 | 第36-50页 |
| 2.1 实验材料 | 第36-37页 |
| 2.1.1 质粒及宿主菌 | 第36页 |
| 2.1.2 培养基 | 第36页 |
| 2.1.3 酶和试剂 | 第36页 |
| 2.1.4 主要仪器 | 第36-37页 |
| 2.2 实验方法 | 第37-39页 |
| 2.2.1 功能酶50kD serralysin基因的原核重组表达质粒的构建及鉴定 | 第37-38页 |
| 2.2.2 重组质粒pET-24b-50在大肠杆菌中的诱导表达与表达蛋白的纯化 | 第38-39页 |
| 2.2.3 异源表达的重组双功能酶50kD serralysin的蛋白酶的相关特性研究 | 第39页 |
| 2.2.4 异源表达的重组双功能酶50kD serralysin的DNA酶的相关特性研究 | 第39页 |
| 2.3 实验结果与分析 | 第39-48页 |
| 2.3.1 双功能酶50kD serralysin的原核重组表达质粒的构建及鉴定 | 第39-40页 |
| 2.3.2 重组质粒pET-24b-50在大肠杆菌中的诱导表达与纯化 | 第40-43页 |
| 2.3.3 重组双功能酶50kD serralysin的蛋白酶相关特性的研究 | 第43-46页 |
| 2.3.4 重组双功能酶50kD serralysin的DNA酶的相关特性的研究 | 第46-48页 |
| 2.4 讨论 | 第48-49页 |
| 2.5 小结 | 第49-50页 |
| 第三章 沙雷氏菌FS14 nucA基因和50kD serralysin基因缺失突变株的构建及突变株胞外分泌蛋白的特性的研究 | 第50-76页 |
| 3.1 实验材料 | 第50-51页 |
| 3.1.1 菌株 | 第50页 |
| 3.1.2 培养基 | 第50页 |
| 3.1.3 主要试剂 | 第50页 |
| 3.1.4 主要仪器 | 第50-51页 |
| 3.2 实验方法 | 第51-58页 |
| 3.2.1 同源重组质粒pUTLD-Kan-nucA的构建 | 第51-53页 |
| 3.2.2 nucA基因缺失突变株的构建 | 第53页 |
| 3.2.3 自杀质粒pUTLD-Kan-50的构建 | 第53-58页 |
| 3.3 实验结果 | 第58-74页 |
| 3.3.1 Kan-nucA的克隆与鉴定 | 第58-60页 |
| 3.3.2 Kan-50基因的克隆与鉴定 | 第60-61页 |
| 3.3.3 nucA基因缺失突变株和50kD serralysin基因缺失突变株的鉴定 | 第61-63页 |
| 3.3.4 nucA基因缺失突变株和50kD serralysin基因缺失突变株胞外分泌蛋白的检测 | 第63页 |
| 3.3.5 nucA基因缺失突变株和50kD serralysin基因缺失突变株胞外分泌蛋白的核酸酶的活性的检测 | 第63-65页 |
| 3.3.6 50kD serralysin基因缺失突变株中50-X蛋白的纯化 | 第65-67页 |
| 3.3.7 50kD serralysin基因缺失突变株中50-X蛋白的核酸酶活性研究 | 第67页 |
| 3.3.8 不同温度预处理50-X蛋白的蛋白酶活性的测定 | 第67-68页 |
| 3.3.9 不同温度预处理后50-X蛋白的DNA酶活性的测定 | 第68-69页 |
| 3.3.10 沙雷氏菌FS14中serralysin家族serralysin-like protease A、B、C三个蛋白的原核重组表达质粒的构建及鉴定 | 第69页 |
| 3.3.11 沙雷氏菌FS14中serralysin家族的三个蛋白的重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达及纯化 | 第69-71页 |
| 3.3.12 沙雷氏菌FS14中serralysin家族三个异源表达的蛋白serralysin-likeprotease A、B、C的核酸酶活性的检测 | 第71页 |
| 3.3.13 不同温度预处理重组蛋白serralysin-like protease A、B、C后其蛋白酶活性的测定 | 第71-73页 |
| 3.3.14 不同温度预处理重组蛋白serralysin-like protease A、B、C后其DNA酶活性的测定 | 第73-74页 |
| 3.4 讨论 | 第74-75页 |
| 3.5 小结 | 第75-76页 |
| 第四章 双功能酶50kD serralysin的DNA酶活性中心的研究 | 第76-86页 |
| 4.1 实验材料 | 第76-77页 |
| 4.1.1 质粒及宿主菌 | 第76页 |
| 4.1.2 培养基 | 第76页 |
| 4.1.3 酶与试剂 | 第76页 |
| 4.1.4 主要仪器设备 | 第76-77页 |
| 4.2 实验方法 | 第77-79页 |
| 4.2.1 突变体的PCR引物设计与合成 | 第77页 |
| 4.2.2 突变体基因的PCR扩增及产物回收 | 第77-78页 |
| 4.2.3 质粒pET-24b的小量制备和纯化 | 第78页 |
| 4.2.4 PCR扩增产物和质粒的酶切、纯化 | 第78页 |
| 4.2.5 目的基因与载体的连接、转化 | 第78页 |
| 4.2.6 重组质粒的筛选鉴定 | 第78页 |
| 4.2.7 重组质粒DNA序列的测定 | 第78页 |
| 4.2.8 重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达与纯化 | 第78页 |
| 4.2.9 定点突变体蛋白的DNA酶活性的测定 | 第78-79页 |
| 4.3 结果与分析 | 第79-84页 |
| 4.3.1 FS14中50kD serralysin蛋白酶定点突变体的构建 | 第79-80页 |
| 4.3.2 50kD serralysin的突变体蛋白的诱导表达及纯化 | 第80-82页 |
| 4.3.3 50kD serralysin突变体蛋白的DNA酶活性的测定 | 第82-84页 |
| 4.4 讨论 | 第84-85页 |
| 4.5 小结 | 第85-86页 |
| 全文总结 | 第86-88页 |
| 研究的主要创新点 | 第88-90页 |
| 参考文献 | 第90-94页 |
| 附录 | 第94-106页 |
| 致谢 | 第106页 |
