| 摘要 | 第4-7页 |
| Abstract | 第7-8页 |
| 第一部分 文献综述 | 第14-32页 |
| 1 汞的性质以及对动植物产生毒害的机制 | 第14-18页 |
| 1.1 汞的性质 | 第14-15页 |
| 1.2 汞污染的来源 | 第15-16页 |
| 1.3 汞对植物毒害作用 | 第16-17页 |
| 1.4 汞对人体的毒害作用 | 第17-18页 |
| 2 生物对汞污染的修复 | 第18-24页 |
| 2.1 微生物对重金属积累与修复 | 第18-20页 |
| 2.2 植物对重金属积累与修复 | 第20-22页 |
| 2.3 转基因在植物修复中的研究 | 第22-24页 |
| 3 与本研究相关的三种蛋白简介 | 第24-27页 |
| 3.1 金属硫蛋白 | 第24-26页 |
| 3.2 谷氨酰合成酶 | 第26页 |
| 3.3 ATP合酶 | 第26-27页 |
| 4 植物抗逆差异蛋白质组学分析 | 第27-28页 |
| 5 盐生植物海马齿研究进展 | 第28-30页 |
| 5.1 海马齿的生物学特性 | 第28-29页 |
| 5.2 海马齿研究进展 | 第29-30页 |
| 6 本研究的立题依据与技术路线 | 第30-31页 |
| 本研究技术路线如下 | 第31-32页 |
| 第二部 实验方法与结果 | 第32-130页 |
| 第一章 汞胁迫下海马齿差异蛋白质组学分析 | 第32-45页 |
| 1 材料与方法 | 第32-35页 |
| 1.1 材料 | 第32页 |
| 1.2 材料处理 | 第32页 |
| 1.3 蛋白质提取 | 第32-33页 |
| 1.4 蛋白质定量 | 第33页 |
| 1.5 双向电泳 | 第33-34页 |
| 1.6 凝胶染色、扫描与数据分析 | 第34页 |
| 1.7 蛋白质质谱(MALDI-TOF MS)鉴定 | 第34-35页 |
| 1.8 二质谱鉴定(MALDI-TOFMS/MS) | 第35页 |
| 1.9 蛋白质分类 | 第35页 |
| 2 结果与分析 | 第35-44页 |
| 2.1 双向电泳 | 第35-37页 |
| 2.2 质谱分析 | 第37-44页 |
| 本章小结 | 第44-45页 |
| 第二章 海马齿耐汞相关基因的克隆 | 第45-71页 |
| 1 材料与方法 | 第45-46页 |
| 1.1 植物材料与处理 | 第45页 |
| 1.2 菌株和载体 | 第45页 |
| 1.3 酶、各种生化试剂吸仪器设备 | 第45-46页 |
| 1.4 常用的培养基配制 | 第46页 |
| 2 实验方法 | 第46-57页 |
| 2.1 RNA提取 | 第46-47页 |
| 2.2 基因克隆 | 第47-57页 |
| 2.2.1 反转录(按试剂盒说明书操作) | 第47-48页 |
| 2.2.2 基因片段获取 | 第48-51页 |
| 2.2.2.1 PCR产物电泳及目的片段回收 | 第49-50页 |
| 2.2.2.2 PCR产物连接测序 | 第50-51页 |
| 2.2.2.2.1 PCR产物连接 | 第50页 |
| 2.2.2.2.2 连接产物转化大肠杆菌(E.coli DH5 α) | 第50-51页 |
| 2.2.2.2.3 重组子的鉴定及测序 | 第51页 |
| 2.2.3 全长序列获得 | 第51-57页 |
| 2.2.3.1 RACE引物设计 | 第51-52页 |
| 2.2.3.2 3'-RACE(参照唐朝荣等的方法,2007) | 第52页 |
| 2.2.3.3 5'-RACE | 第52-57页 |
| 2.2.3.4 片段拼接及全长序列分析 | 第57页 |
| 3 结果与分析 | 第57-70页 |
| 3.1 RNA提取 | 第58页 |
| 3.2 海马齿谷氨酰胺合成酶、金属硫蛋白和ATP基因分离 | 第58-59页 |
| 3.3 谷氨酰胺合成酶、金属硫蛋白全长基因分离 | 第59-60页 |
| 3.4 生物信息学分析 | 第60-65页 |
| 3.5 SpMT、SpGS2、SpF-ATPase-α三个基因的氨基酸序列同源性分析 | 第65-70页 |
| 本章小结 | 第70-71页 |
| 第三章 SpMT、SpGS、SpF-ATP-α基因在微生物中表达及耐性分析 | 第71-85页 |
| 1 SpMT、SpGS、SpF-ATPase基因原核表达载体构建 | 第71-74页 |
| 1.1 引物设计 | 第71页 |
| 1.2 PCR反应 | 第71页 |
| 1.3 原核表达载体的构建 | 第71-72页 |
| 1.4 连接产物转化大肠杆菌(E.coli DH5α)及阳性克隆子的鉴定 | 第72页 |
| 1.5 重组质粒DNA提取 | 第72-73页 |
| 1.6 重组质粒DNA的检测 | 第73-74页 |
| 2 原核表达载体的表达分析 | 第74-75页 |
| 2.1 原核表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3) | 第74页 |
| 2.2 目的基因在大肠杆菌中的诱导表达 | 第74页 |
| 2.3 聚丙烯酰胺变性胶电泳(SDS-PAGE)检测 | 第74-75页 |
| 3 原核表达载体的耐汞性分析 | 第75-76页 |
| 3.1 转化子在含Hg~(2+)的固体培养基上进行抗性分析 | 第75页 |
| 3.2 转化子在含Hg~(2+)的液体培养基中进行抗性分析 | 第75-76页 |
| 3.3 转pCold-sumo-SpMT表达载体的Ecoli Top 10体内汞离子积累浓度的研究 | 第76页 |
| 4 结果与分析 | 第76-83页 |
| 4.1 SpMT原核表达载体的构建与表达 | 第76-78页 |
| 4.1.1 SpMT原核表达载体的构建 | 第76-77页 |
| 4.1.2 SpMT基因原核表达分析 | 第77-78页 |
| 4.2 SpGS和SpF-ATP-α原核表达载体的构建与表达 | 第78-79页 |
| 4.2.1 SpGS和SpF-ATP-α原核表达载体的构建 | 第78页 |
| 4.2.2 SpGS和SpF-ATP-α基因原核表达分析 | 第78-79页 |
| 4.3 SpMT、SpGS和SpF-ATP-α基因在微生物中的表达耐汞性分析 | 第79-83页 |
| 4.3.1 SpMT基因在大肠杆菌TOP 10中表达的耐汞性分析 | 第79-82页 |
| 4.3.1.1 不同原核表达载体对SpMT基因耐汞性影响的初步分析 | 第79-80页 |
| 4.3.1.2 含重组子pCold-sumo-SpMT的E.coli Top 10在固体培养基上的耐汞性分析 | 第80-81页 |
| 4.3.1.3 含重组子pCold-sumo-SpMT的E.coli Top 10在液体培养基上的耐汞性分析 | 第81-82页 |
| 4.3.2 pCold-sumo-SpGS、pCold-sumo-SpF-ATP-α原核达载体耐汞性初步分析 | 第82-83页 |
| 4.4 转pCold-sumo-SpMT表达载体的E.coli Top 10体内汞离子积累浓度的研究 | 第83页 |
| 本章小结 | 第83-85页 |
| 第四章 SpMT、SpGS、SpF-ATP-α基因在植物中的功能分析 | 第85-110页 |
| 1 汞胁迫下海马齿体中SpMT、SpGS、SpF-ATP-α基因表达量变化分析 | 第85-87页 |
| 1.1 实时荧光定量PCR引物设计 | 第85-86页 |
| 1.2 RNA提取 | 第86页 |
| 1.3 反转录 | 第86-87页 |
| 1.4 引物特异性PCR验证 | 第87页 |
| 1.5 荧光定量PCR反应 | 第87页 |
| 2 转SpMT基因拟南芥耐汞性分析 | 第87-96页 |
| 2.1 SpMT基因植物表达载体的构建 | 第88页 |
| 2.1.2 引物设计 | 第88页 |
| 2.1.3 SpMT基因的PCR扩增 | 第88页 |
| 2.1.4 pVKH-35S-SpMT载体的构建 | 第88页 |
| 2.1.5 连接产物转化大肠杆菌(DH5α)及质粒提取 | 第88页 |
| 2.1.6 利用PCR反应及测序对载体质粒进行验证 | 第88页 |
| 2.2 SpMT基因转化拟南芥 | 第88-96页 |
| 2.2.1 农杆菌感受态细胞制作 | 第88-89页 |
| 2.2.2 农杆菌转化(冷冻转化法) | 第89页 |
| 2.2.3 重组农杆菌的筛选与鉴定 | 第89-90页 |
| 2.2.4 拟南芥培养及其管理 | 第90页 |
| 2.2.5 真空渗入法转化拟南芥 | 第90-91页 |
| 2.2.6 T_1代以南芥抗性筛选及抗性苗移栽 | 第91页 |
| 2.2.7 拟南芥阳性转化体鉴定 | 第91-96页 |
| 2.2.7.1 拟南芥DNA提取及PCR鉴定 | 第91-92页 |
| 2.2.7.2 PCR-southern鉴定 | 第92-96页 |
| 3 SpMT基因亚细胞定位研究 | 第96-97页 |
| 3.1 亚细胞定位表达载体的构建 | 第96-97页 |
| 3.1.1 引物设计 | 第96页 |
| 3.1.2 SpMT基因的PCR扩增 | 第96页 |
| 3.1.3 pCAMBIA-1304-35s-SpMT载体的构建 | 第96页 |
| 3.1.4 基因枪法转化洋葱表皮细胞 | 第96-97页 |
| 3.1.4.1 、微弹制作 | 第96-97页 |
| 3.1.5 基因枪法转化洋葱内层表皮细胞及融合蛋白发光部位观察 | 第97页 |
| 4 结果与分析 | 第97-102页 |
| 4.1 PCR引物特异性检测 | 第97-98页 |
| 4.2 内参基因的选定 | 第98页 |
| 4.3 汞胁迫下海马齿SpMT基因表达量变化分析 | 第98-99页 |
| 4.4 汞胁迫下海马齿SpGS基因表达量的变化分析 | 第99-100页 |
| 4.5 汞胁迫下海马齿SpF-ATP-α基因表达分析 | 第100-101页 |
| 4.6 SpMT、SpGS、SpF-ATP-α基因组织特异性表达分析 | 第101-102页 |
| 5 转SpMT基因拟南芥的耐汞性分析 | 第102-105页 |
| 5.1 T1代抗性苗蹄选 | 第102-103页 |
| 5.2 转基因T_1代抗性苗的PCR与PCRsouthem检测 | 第103页 |
| 5.3 T1代抗性苗的耐汞性分析 | 第103-105页 |
| 6 SpMT基因表达产物在细胞中的定位分析 | 第105-108页 |
| 本章小结 | 第108-110页 |
| 第五章 汞胁迫下海马齿酶活性以及形态、结构变化 | 第110-123页 |
| 1 汞胁迫下海马齿谷酰胺合成酶活性与-ATP合酶活性测定 | 第110-112页 |
| 1.1 材料 | 第110页 |
| 1.2 技术与方法 | 第110-112页 |
| 1.2.1 谷氨酰胺合成酶(GS)活性的测定 | 第110-111页 |
| 1.2.2 F-ATPase活性测定 | 第111-112页 |
| 2 重金属汞对海马齿叶片毒害的透射电镜观察 | 第112-113页 |
| 2.1 材料处理 | 第112页 |
| 2.2 超薄切片制作及电镜观察 | 第112-113页 |
| 3 重金属汞胁迫下海马齿根、茎、叶的扫描电镜观察 | 第113页 |
| 3.1 材料处理及观察 | 第113页 |
| 4 结果与分析 | 第113-121页 |
| 4.1 汞胁迫下海马齿谷氨酰胺合成酶活性的变化 | 第113-114页 |
| 4.2 汞胁迫下海马齿F-ATP合酶活性的变化 | 第114-116页 |
| 4.2.1 磷标线的制作 | 第114-115页 |
| 4.2.2 不同浓度不同时间处理下海马齿谷F-ATP合酶活性的变化 | 第115-116页 |
| 4.3 汞离子对海马齿叶片超微结构的影响 | 第116-119页 |
| 4.3.1 Hg~(2+)胁迫下海马齿叶肉细胞叶绿体的变化 | 第116-117页 |
| 4.3.2 Hg~(2+)胁迫下海马齿叶肉细胞线粒体的变化 | 第117页 |
| 4.3.3 Hg~(2+)胁迫下海马齿叶肉细胞核的变化 | 第117页 |
| 4.3.4 Hg~(2+)胁迫下海马齿叶肉细胞细胞壁与细胞膜结构的变化 | 第117-119页 |
| 4.4 汞离子对海马齿根、茎、叶结构的影响 | 第119-121页 |
| 4.4.1 根表面的观察 | 第119-120页 |
| 4.4.2 茎横切面的观察 | 第120页 |
| 4.4.3 叶片表面的观察 | 第120-121页 |
| 本章小结 | 第121-123页 |
| 第六章 讨论与结论 | 第123-130页 |
| 1 讨论 | 第123-128页 |
| 1.1 海马齿通过改变蛋白的表达适应汞的胁迫 | 第123-125页 |
| 1.2 SpMTs、SpGS、SpF-ATP-α在海马齿植物中对汞胁迫的应答 | 第125-126页 |
| 1.3 海马齿通过改变生理、结构及形态上的一些现象适应汞的胁迫 | 第126-128页 |
| 2 结论 | 第128-130页 |
| 参考文献 | 第130-141页 |
| 致谢 | 第141页 |
