| 摘要 | 第5-7页 |
| ABSTRACT | 第7-8页 |
| 第一章 引言 | 第14-33页 |
| 1.1 斑马鱼背景介绍 | 第14-21页 |
| 1.1.1 斑马鱼的发育过程 | 第14-20页 |
| 1.1.1.1 合子期（zygote period）特征 | 第14-15页 |
| 1.1.1.2 分裂期（cleavage period）特征 | 第15-16页 |
| 1.1.1.3 囊胚期（gastrula period）特征 | 第16-17页 |
| 1.1.1.4 原肠胚时期（gastrula period）特征 | 第17-19页 |
| 1.1.1.5 体节期（segmentation period）特征 | 第19页 |
| 1.1.1.6 咽裂期（pharyngula period）特征 | 第19页 |
| 1.1.1.7 孵化期（hatching period）特征 | 第19-20页 |
| 1.1.1.8 幼鱼阶段（early larval period）特征 | 第20页 |
| 1.1.2 运用斑马鱼为模式生物的相关科学研究 | 第20-21页 |
| 1.2 造血干细胞的背景介绍 | 第21-24页 |
| 1.2.1 造血干细胞自我更新及分化 | 第21-24页 |
| 1.2.2 造血干细胞的分子调控机制 | 第24页 |
| 1.3 斑马鱼作为模式生物研究血液系统的介绍 | 第24-25页 |
| 1.4 斑马鱼作为模式生物研究造血干细胞的优势 | 第25-27页 |
| 1.5 斑马鱼作为模式生物研究造血干细胞的保守性分析 | 第27-30页 |
| 1.5.1 斑马鱼的造血位置与哺乳动物高度保守 | 第27-28页 |
| 1.5.2 斑马鱼造血的分子调控网络与哺乳动物高度保守 | 第28-30页 |
| 1.6 斑马鱼作为模式生物在其它领域的研究应用 | 第30-33页 |
| 1.6.1 在发育生物学中的应用 | 第30页 |
| 1.6.2 前向遗传学方法筛选突变基因 | 第30-31页 |
| 1.6.3 斑马鱼在药物筛选中的应用 | 第31页 |
| 1.6.4 在人类疾病中的应用 | 第31-33页 |
| 第二章 正向遗传学筛选影响造血干细胞的斑马鱼突变家系 | 第33-49页 |
| 2.1 前沿 | 第33-36页 |
| 2.1.1 化学诱变剂ENU简介 | 第33-34页 |
| 2.1.2 ENU诱导雄性斑马鱼基因组随机点突变 | 第34页 |
| 2.1.3 正向遗传学筛选斑马鱼突变家系的策略 | 第34-36页 |
| 2.2 材料与方法 | 第36-44页 |
| 2.2.1 斑马鱼胚胎及的成鱼饲养 | 第36-37页 |
| 2.2.1.1 斑马鱼胚胎的饲养 | 第36-37页 |
| 2.2.1.2 斑马鱼成鱼的饲养 | 第37页 |
| 2.2.2 正向遗传学策略获取造血干细胞异常的斑马鱼突变家系 | 第37-38页 |
| 2.2.2.1 经典的三代遗传学筛选斑马鱼突变家系 | 第37-38页 |
| 2.2.2.2 突变基因的遗传及保留 | 第38页 |
| 2.2.3 互补分析筛查携带有相同突变的斑马鱼家系 | 第38-39页 |
| 2.2.4 全胚胎原位杂交（WISH） | 第39-42页 |
| 2.2.4.1 原位杂交探针的制备 | 第39-41页 |
| 2.2.4.2 全胚胎原位杂交 | 第41-42页 |
| 2.2.5 试剂 | 第42-44页 |
| 2.2.5.1 斑马鱼胚胎饲养试剂 | 第42-43页 |
| 2.2.5.2 原位杂交体外转录试剂 | 第43页 |
| 2.2.5.3 原位杂交试剂 | 第43-44页 |
| 2.3 结果 | 第44-47页 |
| 2.3.1 斑马鱼突变家系F2代的筛选总结 | 第44-47页 |
| 2.3.1.1 造血干细胞减少实例（5dpf） | 第44-45页 |
| 2.3.1.2 造血干细胞增加实例（5dpf） | 第45页 |
| 2.3.1.3 造血干细胞缺失实例（5dpf） | 第45-46页 |
| 2.3.1.4 造血干细胞迁移异常实例（5dpf） | 第46-47页 |
| 2.4 讨论 | 第47-49页 |
| 第三章 ldd794突变家系的定位克隆 | 第49-83页 |
| 3.1 前言 | 第49-51页 |
| 3.1.1 定位克隆的原理 | 第49-51页 |
| 3.2 材料与方法 | 第51-71页 |
| 3.2.1 ldd794突变家系的表型分析 | 第51-52页 |
| 3.2.2 用于定位克隆的mapping斑马鱼家系的饲养 | 第52页 |
| 3.2.3 对携带有隐性突变位点的成鱼的筛选 | 第52页 |
| 3.2.4 定位克隆胚胎的准备 | 第52-53页 |
| 3.2.4.1 全胚胎原位杂交筛选突变胚胎 | 第53页 |
| 3.2.4.2 单胚胎基因组DNA提取 | 第53页 |
| 3.2.5 定位克隆 | 第53-57页 |
| 3.2.5.1 突变基因所在染色体的确定 | 第54页 |
| 3.2.5.2 突变基因所在范围的确定 | 第54-55页 |
| 3.2.5.3 突变基因位点的确定 | 第55-57页 |
| 3.2.6 定位克隆引物的选择 | 第57-69页 |
| 3.2.6.1 定位染色体所需引物 | 第57-59页 |
| 3.2.6.2 缩小染色体位置所需引物 | 第59-69页 |
| 3.2.7 基因测序引物的设计 | 第69-71页 |
| 3.3 结果 | 第71-81页 |
| 3.3.1 突变基因为dnmt1 | 第71-73页 |
| 3.3.2 斑马鱼dnmt1和人类DNMT1高度保守 | 第73-74页 |
| 3.3.3 ldd794突变家系的表型 | 第74-81页 |
| 3.3.3.1 ldd794突变家系的造血干细胞减少直至缺失 | 第74-77页 |
| 3.3.3.2 ldd794突变家系的下游各系成熟细胞均减少或缺失 | 第77-78页 |
| 3.3.3.3 ldd794突变家系原始造血不受影响 | 第78-79页 |
| 3.3.3.4 ldd794突变家系血管生成不受影响 | 第79-80页 |
| 3.3.3.5 ldd794突变家系肝脏和胰腺发育异常 | 第80-81页 |
| 3.4 讨论 | 第81-83页 |
| 第四章 斑马鱼dnmt1基因突变导致造血干细胞减少的分子机制研究 | 第83-124页 |
| 4.1 前言 | 第83-87页 |
| 4.1.1 DNA甲基化在造血干细胞中的研究简介 | 第83-87页 |
| 4.1.1.1 DNA甲基转移酶(DNMT)家族 | 第83-84页 |
| 4.1.1.2 DNMT3a和DNMT3b对造血干细胞的作用 | 第84-85页 |
| 4.1.1.3 DNMT1对造血干细胞的作用 | 第85-86页 |
| 4.1.1.4 Dnmts在白血病中的研究进展 | 第86-87页 |
| 4.2 材料与方法 | 第87-103页 |
| 4.2.1 全胚胎原位杂交（WISH） | 第87-88页 |
| 4.2.2 Morpholino设计及显微注射 | 第88-90页 |
| 4.2.2.1 Morpholino设计 | 第89页 |
| 4.2.2.2 Morpholino测效 | 第89-90页 |
| 4.2.2.3 Morpholino显微注射 | 第90页 |
| 4.2.3 质粒构建 | 第90-93页 |
| 4.2.4 体外转录制备基因的polyA加帽m RNA及显微注射 | 第93-94页 |
| 4.2.5 磷酸化组蛋白 3（pH3）和GFP双标免疫荧光染色 | 第94-95页 |
| 4.2.6 全胚胎介导的dUTP缺口标记(TUNEL)和GFP双标免疫荧光检测 | 第95页 |
| 4.2.7 胚胎GFP荧光标记细胞的流式分选 | 第95-96页 |
| 4.2.8 实时定量PCR（Q-PCR）检测基因表达量 | 第96-98页 |
| 4.2.8.1 mRNA和DNA的提取 | 第97页 |
| 4.2.8.2 cDNA的制备 | 第97-98页 |
| 4.2.8.3 实时定量PCR | 第98页 |
| 4.2.9 全基因组甲基化检测 | 第98-100页 |
| 4.2.10 cebpa基因调控区域甲基化检测 | 第100-103页 |
| 4.2.10.1 甲基化测序区域的确定 | 第100页 |
| 4.2.10.2 甲基化测序引物的设计 | 第100-101页 |
| 4.2.10.3 重亚硫酸盐测序 | 第101-102页 |
| 4.2.10.4 测序结果的分析 | 第102-103页 |
| 4.3 结果 | 第103-121页 |
| 4.3.1 dnmt1基因在斑马鱼胚胎时期泛在表达 | 第103-104页 |
| 4.3.2 ldd794突变胚胎整体基因组甲基化水平降低 | 第104页 |
| 4.3.3 基因敲低及拯救实验证实突变基因确是dnmt1 | 第104-108页 |
| 4.3.3.1 Morpholino敲低dnmt1可重复突变家系ldd794的表型 | 第105-106页 |
| 4.3.3.2 dnmt1全长mRNA可以回复dnmt1 morphants及mutants的造血表型 | 第106-108页 |
| 4.3.4 造血干细胞缺失dnmt1后增殖能力减弱 | 第108-111页 |
| 4.3.5 造血干细胞缺失dnmt1后凋亡无变化 | 第111页 |
| 4.3.6 造血干细胞缺失dnmt1后cebpa的表达量上调 | 第111-113页 |
| 4.3.7 造血干细胞缺失dnmt1后导致cebpa调控区域的甲基化水平下调 | 第113-115页 |
| 4.3.8 抑制形式的SUMO2-C/ebpa可以恢复造血干细胞减少的表型 | 第115-117页 |
| 4.3.9 抑制形式的SUMO2-C/ebpa不能恢复dnmt1突变胚胎中肝脏和胰腺发育异常的表型 | 第117-118页 |
| 4.3.10 dnmt1及cebpa双缺失的胚胎造血干细胞正常 | 第118-121页 |
| 4.4 讨论 | 第121-124页 |
| 参考文献 | 第124-135页 |
| 致谢 | 第135-137页 |
| 发表文章目录 | 第137-138页 |
| 综述 | 第138-144页 |
| 参考文献 | 第142-144页 |
