| 致谢 | 第5-6页 |
| 中文摘要 | 第6-8页 |
| 英文摘要 | 第8-9页 |
| 缩略词表 | 第10-17页 |
| 1 引言 | 第17-31页 |
| 1.1 炎症反应与NF-κB信号传导通路 | 第17-19页 |
| 1.2 泛素化、多聚泛素链以及蛋白激酶TAK1的激活 | 第19-23页 |
| 1.3 泛素结合酶E2催化泛素链合成的内在反应活性 | 第23-24页 |
| 1.4 Ubc13合成K63泛素链的特异性及在细胞中的调节作用 | 第24-27页 |
| 1.5 黄酮类化合物及其抗炎作用 | 第27-29页 |
| 1.6 NF-κB信号通路中的药物靶点 | 第29-31页 |
| 2 材料和方法 | 第31-43页 |
| 2.1 材料 | 第31-34页 |
| 2.1.1 细胞系 | 第31页 |
| 2.1.2 缓冲液 | 第31-32页 |
| 2.1.3 小分子化合物 | 第32页 |
| 2.1.4 试剂和抗体 | 第32-33页 |
| 2.1.5 载体及菌株 | 第33页 |
| 2.1.6 主要设备和软件 | 第33-34页 |
| 2.2 方法 | 第34-43页 |
| 2.2.1 载体的构建和质粒的提取 | 第34页 |
| 2.2.2 细胞复苏、培养和冻存 | 第34-35页 |
| 2.2.3 细胞转染 | 第35页 |
| 2.2.4 稳定表达细胞系的构建 | 第35页 |
| 2.2.5 实时定量PCR | 第35-37页 |
| 2.2.6 蛋白表达 | 第37页 |
| 2.2.7 常用蛋白纯化方法 | 第37-38页 |
| 2.2.8 Ub～Ubc13/Uev2复合物的纯化 | 第38-39页 |
| 2.2.9 体外TAK1激酶活力实验 | 第39页 |
| 2.2.10 制备细胞裂解液S20 | 第39页 |
| 2.2.11 体外激活TAK1实验 | 第39页 |
| 2.2.12 体外泛素化反应 | 第39-40页 |
| 2.2.13 体外泛素活化与结合反应 | 第40页 |
| 2.2.14 Ubc13/Uev2转硫酯反应 | 第40-41页 |
| 2.2.15 体外泛素氨解反应及泛素链的合成 | 第41页 |
| 2.2.16 免疫荧光 | 第41-42页 |
| 2.2.18 GST-K63UIMs Pull-down实验分析胞内K63泛素链 | 第42页 |
| 2.2.19 小分子化合物与Ubc13/Uev2的共结晶与结构解析 | 第42-43页 |
| 3 实验结果 | 第43-86页 |
| 3.1 黄酮类化合物抑制LPS和IL-1B促炎症因子信号通路 | 第43-47页 |
| 3.1.1 黄酮类化合物抑制LPS和IL-1β诱导的TAK1磷酸化 | 第43-44页 |
| 3.1.2 黄酮类化合物抑制LPS和IL-1β诱导的NF-κB靶基因表达 | 第44-45页 |
| 3.1.3 黄酮类化合物不抑制TAK1的激酶活性 | 第45-47页 |
| 3.2 黄酮类化合物抑制K63多聚泛素链的合成 | 第47-50页 |
| 3.2.1 黄酮类化合物抑制IL-1β诱导的胞内K63多聚泛素化反应 | 第47-49页 |
| 3.2.2 黄酮类化合物抑制体外K63多聚泛素化反应 | 第49-50页 |
| 3.3 黄酮类化合物特异地抑制Ubc13/Uev2介导的K63泛素链合成 | 第50-52页 |
| 3.3.1 黄酮类化合物抑制体外K63泛素化不依赖于特定E3泛素连接酶 | 第50-51页 |
| 3.3.2 黄酮类化合物对体外K63多聚泛素化反应的抑制具有特异性 | 第51-52页 |
| 3.4 黄酮类化合物抑制K63泛素化反应的生化机制 | 第52-60页 |
| 3.4.1 黄酮类化合物不抑制E1对泛素的活化反应 | 第52-53页 |
| 3.4.2 黄酮类化合物不抑制Ubc13对泛素的转硫酯反应 | 第53-54页 |
| 3.4.3 黄酮类化合物不影响Uev2与Ubc13的相互作用 | 第54-55页 |
| 3.4.4 黄酮类化合物不影响Uev2结合多聚泛素链 | 第55-57页 |
| 3.4.5 黄酮类化合物抑制体外单步氨解反应 | 第57-58页 |
| 3.4.6 黄酮类化合物抑制体外连续多次氨解反应及泛素链的合成 | 第58-59页 |
| 3.4.7 黄酮类化合物抑制胞内泛素氨解反应及K63泛素链的合成 | 第59-60页 |
| 3.5 泛素结合酶Ubc13/Uev2是黄酮类化合物抗炎作用的主要靶点 | 第60-62页 |
| 3.5.1 黄酮类化合物在体外反应中抑制TAK1的激活 | 第60-61页 |
| 3.5.2 体外TAK1激活反应中回补Ubc13/Uev2可以抵消Luteolin的抑制作用 | 第61-62页 |
| 3.6 黄酮类化合物与泛素结合酶Ubc13/Uev2直接互作的动力学分析 | 第62-67页 |
| 3.6.1 SPR测定黄酮类化合物与Ubc13/Uev2结合解离平衡常数 | 第62-64页 |
| 3.6.2 黄酮类化合物Morin的半效抑制浓度IC50 | 第64-67页 |
| 3.7 黄酮类化合物抑制K63泛素化反应的构效关系分析 | 第67-75页 |
| 3.7.1 共轭的C环是黄酮类化合物抑制泛素化反应的必要条件 | 第69-71页 |
| 3.7.2 黄酮类化合物A环上至少一个羟基是抑制活力所必需的 | 第71-72页 |
| 3.7.3 黄酮类化合物B环两个羟基的空间取向对抑制活力有关键作用 | 第72-74页 |
| 3.7.4 黄酮类化合物主要与靶蛋白通过氢键互作且提供氢原子 | 第74-75页 |
| 3.8 黄酮类化合物与Ubc13的结合位点分析 | 第75-79页 |
| 3.9 黄酮类化合物抑制致电离辐射诱导的DNA损伤修复 | 第79-81页 |
| 3.10 黄酮类化合物抑制LPS诱导的原代巨噬细胞促炎症细胞因子分泌 | 第81-82页 |
| 3.11 在LPS引起的脓毒症小鼠模型中,黄酮类化合物能够缓解炎症 | 第82-86页 |
| 4 讨论 | 第86-88页 |
| 5 小结 | 第88-89页 |
| 参考文献 | 第89-96页 |
| 作者简历 | 第96页 |
