| 摘要 | 第5-7页 |
| Abstract | 第7-9页 |
| 英文缩略词表 | 第14-15页 |
| 第一章 绪论 | 第15-34页 |
| 1.1 漆酶的概述 | 第15-27页 |
| 1.1.1 漆酶的来源与分布 | 第15-17页 |
| 1.1.2 细菌漆酶的序列与结构特征 | 第17-22页 |
| 1.1.3 细菌漆酶的催化氧化和电子传递 | 第22-26页 |
| 1.1.4 细菌漆酶的应用 | 第26-27页 |
| 1.2 新酶基因挖掘技术的研究进展 | 第27-30页 |
| 1.2.1 利用基因组数据库挖掘技术挖掘新酶基因 | 第28-29页 |
| 1.2.2 宏基因组文库挖掘新酶基因 | 第29-30页 |
| 1.3 分子模拟技术在酶蛋白质结构与功能研究的应用 | 第30-32页 |
| 1.3.1 同源建模 | 第30-31页 |
| 1.3.2 分子对接 | 第31-32页 |
| 1.4 本课题的研究意义及主要内容 | 第32-34页 |
| 1.4.1 本课题的研究意义 | 第32-33页 |
| 1.4.2 主要研究内容 | 第33-34页 |
| 第二章 新型细菌漆酶的挖掘 | 第34-50页 |
| 2.1 引言 | 第34页 |
| 2.2 材料与设备 | 第34-38页 |
| 2.2.1 菌株、载体和引物 | 第34-35页 |
| 2.2.2 主要仪器和设备 | 第35-36页 |
| 2.2.3 主要试剂和试剂盒 | 第36页 |
| 2.2.4 培养基与溶液配制 | 第36-38页 |
| 2.3 实验方法 | 第38-44页 |
| 2.3.1 细菌漆酶序列的筛选和生物信息学分析 | 第38页 |
| 2.3.2 重组细菌漆酶表达载体的构建 | 第38-41页 |
| 2.3.3 大肠杆菌重组表达菌株的构建及重组蛋白的诱导表达 | 第41-42页 |
| 2.3.4 重组漆酶的活性检测 | 第42页 |
| 2.3.5 重组蛋白的提取与纯化 | 第42-43页 |
| 2.3.6 SDS-PAGE分析 | 第43-44页 |
| 2.3.7 pH值对重组漆酶酶活的影响 | 第44页 |
| 2.3.8 温度对重组漆酶酶活的影响 | 第44页 |
| 2.4 结果与讨论 | 第44-49页 |
| 2.4.1 细菌漆酶的预测和生物信息学分析 | 第44-45页 |
| 2.4.2 重组表达载体的构建及鉴定 | 第45-46页 |
| 2.4.3 重组蛋白的诱导表达、漆酶活性检测及纯化 | 第46-48页 |
| 2.4.4 三个重组细菌漆酶的最适温度比较 | 第48页 |
| 2.4.5 三个重组细菌漆酶的最适pH比较 | 第48-49页 |
| 2.5 小结 | 第49-50页 |
| 第三章 新型细菌漆酶LacTT在毕赤酵母的表达及其酶特性研究 | 第50-69页 |
| 3.1 引言 | 第50页 |
| 3.2 材料与设备 | 第50-52页 |
| 3.2.1 菌株、载体和引物 | 第50-51页 |
| 3.2.2 主要仪器和设备 | 第51页 |
| 3.2.3 主要试剂和试剂盒 | 第51页 |
| 3.2.4 培养基与溶液配制 | 第51-52页 |
| 3.3 实验方法 | 第52-60页 |
| 3.3.1 毕赤酵母重组表达载体pHKFA-LacTT的构建 | 第52-53页 |
| 3.3.2 通过串联表达盒体外构建LacTT多拷贝重组载体 | 第53-55页 |
| 3.3.3 重组毕赤酵母表达体系的构建 | 第55-56页 |
| 3.3.4 荧光定量PCR检测重组酵母LacTT基因数量 | 第56-57页 |
| 3.3.5 重组LacTT的诱导表达及纯化 | 第57-58页 |
| 3.3.6 SDS-PAGE、酶谱分析和蛋白质浓度测定 | 第58页 |
| 3.3.7 重组漆酶的酶学性质分析 | 第58-59页 |
| 3.3.8 重组LacTT对工业染料的脱色性能研究 | 第59-60页 |
| 3.4 结果与讨论 | 第60-68页 |
| 3.4.1 LacTT单拷贝重组表达载体的构建和鉴定 | 第60-61页 |
| 3.4.2 LacTT的多拷贝重组表达载体的构建及鉴定 | 第61页 |
| 3.4.3 毕赤酵母重组菌株的构建及鉴定 | 第61-63页 |
| 3.4.4 重组LacTT的诱导表达及纯化 | 第63-64页 |
| 3.4.5 重组LacTT的酶学性质分析 | 第64-67页 |
| 3.4.6 重组LacTT在工业染料脱色中的应用初探 | 第67-68页 |
| 3.5 本章小结 | 第68-69页 |
| 第四章 漆酶LacTT底物结合关键氨基酸及其功能研究 | 第69-86页 |
| 4.1 引言 | 第69页 |
| 4.2 材料与设备 | 第69-71页 |
| 4.2.1 菌株、载体和引物 | 第69-70页 |
| 4.2.2 主要仪器和设备 | 第70-71页 |
| 4.2.3 主要试剂和试剂盒 | 第71页 |
| 4.2.4 培养基与溶液配制 | 第71页 |
| 4.3 实验方法 | 第71-73页 |
| 4.3.1 LacTT的同源建模和关于底物结合关键氨基酸的选择 | 第71页 |
| 4.3.2 LacTT定点突变及其表达载体的构建 | 第71-72页 |
| 4.3.3 突变体蛋白在大肠杆菌的表达、纯化及SDS-PAGE分析 | 第72页 |
| 4.3.4 突变体蛋白的酶学性质分析 | 第72-73页 |
| 4.3.5 突变体蛋白的紫外可见吸收光谱分析 | 第73页 |
| 4.3.6 LacTT关于底物结合关键氨基酸的虚拟突变 | 第73页 |
| 4.4 结果与讨论 | 第73-84页 |
| 4.4.1 LacTT的同源建模 | 第73-75页 |
| 4.4.2 LacTT关于底物结合关键氨基酸的预测 | 第75-77页 |
| 4.4.3 关于底物结合关键氨基酸的突变及其原核表达载体的构建 | 第77-78页 |
| 4.4.4 底物结合关键氨基酸突变体蛋白的诱导表达和纯化 | 第78页 |
| 4.4.5 底物结合关键氨基酸突变体蛋白的最适反应温度和热稳定性 | 第78-79页 |
| 4.4.6 底物结合关键氨基酸突变体蛋白的最适反应pH | 第79-80页 |
| 4.4.7 底物结合关键氨基酸突变体蛋白的紫外可见吸收光谱分析 | 第80-81页 |
| 4.4.8 突变体蛋白的反应动力学参数、空间结构及关键位点的功能研究 | 第81-84页 |
| 4.5 本章小结 | 第84-86页 |
| 第五章 漆酶LacTT电子传递机制及关键氨基酸功能研究 | 第86-105页 |
| 5.1 引言 | 第86页 |
| 5.2 材料与设备 | 第86-87页 |
| 5.2.1 菌株、载体和引物 | 第86-87页 |
| 5.2.2 主要仪器和设备 | 第87页 |
| 5.2.3 主要试剂和试剂盒 | 第87页 |
| 5.2.4 培养基与溶液配制 | 第87页 |
| 5.3 实验方法 | 第87-89页 |
| 5.3.1 LacTT电子传递关键氨基酸的选择 | 第87-88页 |
| 5.3.2 LacTT的定点突变及其突变体表达载体构建 | 第88-89页 |
| 5.3.3 LacTT突变体蛋白的诱导表达、纯化及SDS-PAGE分析 | 第89页 |
| 5.3.4 LacTT和LacTT突变体蛋白的酶学性质分析与比较 | 第89页 |
| 5.3.5 LacTT和LacTT突变体蛋白的紫外可见吸收光谱比较分析 | 第89页 |
| 5.3.6 LacTT的虚拟氨基酸突变 | 第89页 |
| 5.4 结果与讨论 | 第89-103页 |
| 5.4.1 LacTT关于电子传递关键氨基酸的预测 | 第89-92页 |
| 5.4.2 电子传递关键位点突变基因及其重组突变体表达载体的构建 | 第92页 |
| 5.4.3 LacTT及其电子传递关键位点突变体蛋白的诱导表达和纯化 | 第92-93页 |
| 5.4.4 LacTT及其突变体的最适反应温度和热稳定性比较 | 第93-95页 |
| 5.4.5 LacTT及其突变体蛋白的最适反应pH比较 | 第95页 |
| 5.4.6 LacTT及其突变体蛋白的紫外可见吸收光谱分析 | 第95-97页 |
| 5.4.7 LacTT突变体的动力学参数、空间结构及关键位点的功能研究 | 第97-102页 |
| 5.4.8 漆酶LacTT的电子传递机制 | 第102-103页 |
| 5.5 本章小结 | 第103-105页 |
| 结论与展望 | 第105-108页 |
| 结论 | 第105-106页 |
| 本论文创新点 | 第106-107页 |
| 展望 | 第107-108页 |
| 参考文献 | 第108-119页 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 | 第119-120页 |
| 致谢 | 第120-121页 |
| 附件 | 第121页 |
