| 摘要 | 第11-14页 |
| Abstract | 第14-16页 |
| 第一章 前言 | 第17-30页 |
| 1.1 黑色素的概况 | 第17-20页 |
| 1.1.1 黑色素的基本性质和分布 | 第17页 |
| 1.1.2 黑色素的分类及其合成的途径 | 第17-19页 |
| 1.1.3 黑色素合成的关键性基因 | 第19-20页 |
| 1.1.4 黑色素合成过程中的中间产物 | 第20页 |
| 1.2 催化黑色素合成相关酶的介绍 | 第20-26页 |
| 1.2.1 羟苯丙酮酸双加氧酶的研究概况 | 第21-24页 |
| 1.2.2 酪氨酸酶的研究概况 | 第24-26页 |
| 1.3 中间气单胞菌WS的研究概况 | 第26-27页 |
| 1.3.1 气单胞菌的简介 | 第26-27页 |
| 1.3.2 本实验室对中间气单胞菌WS(A.media WS)的前期研究概况 | 第27页 |
| 1.4 转座子相关报道 | 第27-28页 |
| 1.5 本研究的目的和意义 | 第28-30页 |
| 第二章 改造Tn5系列的转座子使其适用于中间气单胞菌WS | 第30-45页 |
| 2.1 实验材料 | 第30-33页 |
| 2.1.1 菌株 | 第31页 |
| 2.1.2 质粒 | 第31页 |
| 2.1.3 药品 | 第31-32页 |
| 2.1.4 溶液的配制 | 第32-33页 |
| 2.2 实验方法 | 第33-37页 |
| 2.2.1 引物设计 | 第33页 |
| 2.2.2 相应基因的扩增 | 第33-34页 |
| 2.2.3 电泳 | 第34页 |
| 2.2.4 胶回收 | 第34-35页 |
| 2.2.5 连接T载体 | 第35页 |
| 2.2.6 大肠杆菌感受态的制备及转化 | 第35-36页 |
| 2.2.7 质粒DNA的制备方法 | 第36页 |
| 2.2.8 酶切 | 第36-37页 |
| 2.2.9 连接 | 第37页 |
| 2.3 结果和分析 | 第37-44页 |
| 2.3.1 对两种含Tn5转座子的质粒进行相应的抗性改造 | 第37-44页 |
| 2.4 小结和讨论 | 第44-45页 |
| 第三章 检测改造后含Tn5转座子的质粒是否适用中间气单胞菌WS | 第45-60页 |
| 3.1 实验材料 | 第45-47页 |
| 3.1.1 实验菌株 | 第45页 |
| 3.1.2 质粒 | 第45页 |
| 3.1.3 药品 | 第45-46页 |
| 3.1.4 溶液的配制 | 第46-47页 |
| 3.1.5 引物 | 第47页 |
| 3.1.6 仪器耗材 | 第47页 |
| 3.2 实验方法 | 第47-52页 |
| 3.2.1 二亲本接合 | 第47-48页 |
| 3.2.2 菌落PCR扩增 | 第48页 |
| 3.2.3 提取气单胞菌WS的总DNA | 第48-49页 |
| 3.2.4 大肠杆菌感受态的制备和转化 | 第49页 |
| 3.2.5 PCR扩增 | 第49页 |
| 3.2.6 引物设计 | 第49页 |
| 3.2.7 基因组酶切 | 第49页 |
| 3.2.8 Southern印迹的方法 | 第49-50页 |
| 3.2.9 用放射性同位素标记DNA探针的方法 | 第50页 |
| 3.2.10 放射性同位素标记的探针和膜上的DNA杂交 | 第50-51页 |
| 3.2.11 显影的方法 | 第51页 |
| 3.2.12 转座子挽救以调取转座子打断的侧翼序列 | 第51页 |
| 3.2.13 去磷酸化的方法 | 第51页 |
| 3.2.14 乙醇沉淀回收DNA的方法 | 第51-52页 |
| 3.2.15 连接 | 第52页 |
| 3.3 结果和分析 | 第52-59页 |
| 3.3.1 验证pTnMod-O-Cm是否在中间气单胞菌WS中可以发挥功能 | 第52-55页 |
| 3.3.2 验证pTnCm是否在中间气单胞菌WS中实现转座 | 第55-59页 |
| 3.4 小结与讨论 | 第59-60页 |
| 第四章 使用改造好的含Tn5转座子的pTnCm于中间气单胞菌WS中进行随机突变和筛库 | 第60-75页 |
| 4.1 实验材料 | 第60-62页 |
| 4.1.1 实验菌株 | 第60页 |
| 4.1.2 质粒 | 第60-61页 |
| 4.1.3 药品 | 第61页 |
| 4.1.4 溶液的配制 | 第61页 |
| 4.1.5 引物 | 第61-62页 |
| 4.1.6 仪器耗材 | 第62页 |
| 4.2 实验方法 | 第62-63页 |
| 4.2.1 二亲本接合的方法 | 第62页 |
| 4.2.2 转座子随机突变筛库的方法 | 第62页 |
| 4.2.3 黑色素含量的测定 | 第62页 |
| 4.2.4 测定菌体浓度 | 第62-63页 |
| 4.2.5 转座子挽救 | 第63页 |
| 4.2.6 Tail-PCR(热不对称交错Thermal Asymmetric Interlaced PCR) | 第63页 |
| 4.3 结果和分析 | 第63-74页 |
| 4.3.1 筛库,以得到色素表型有改变的WS突变株 | 第63-67页 |
| 4.3.2 确定12株所得到的色素表型变化的WS突变株被转座子打断的位置 | 第67-74页 |
| 4.4 小结与讨论 | 第74-75页 |
| 第五章 脓黑色素是中间气单胞菌WS中主要合成的色素 | 第75-125页 |
| 5.1 实验材料 | 第75-82页 |
| 5.1.1 实验菌株 | 第75-76页 |
| 5.1.2 质粒 | 第76-78页 |
| 5.1.3 药品 | 第78页 |
| 5.1.4 溶液的配制 | 第78页 |
| 5.1.5 引物 | 第78-82页 |
| 5.1.6 仪器耗材 | 第82页 |
| 5.2 实验方法 | 第82-87页 |
| 5.2.1 利用高效液相色谱(High-performance liquid chromatography,HPLC)来分析黑色素合成中重要中间产物 | 第82-83页 |
| 5.2.2 质谱(Mass spectrometry) | 第83页 |
| 5.2.3 敲除载体的构建 | 第83-84页 |
| 5.2.4 通过同源重组来敲除目的基因 | 第84-85页 |
| 5.2.5 通过同源重组来敲除目的基因的过程 | 第85页 |
| 5.2.6 回补载体的构建 | 第85-86页 |
| 5.2.7 异源表达 | 第86页 |
| 5.2.8 提取总RNA的方法 | 第86-87页 |
| 5.2.9 RT-PCR的方法 | 第87页 |
| 5.3 结果和分析 | 第87-123页 |
| 5.3.1 高效液相色谱(HPLC)研究中间气单胞菌WS中色素合成的中间产物 | 第87-93页 |
| 5.3.2 分析中间气单胞菌WS全基因组序列 | 第93-94页 |
| 5.3.3 研究WS中的脓黑色素合成途径中各个基因的功能 | 第94-117页 |
| 5.3.4 研究Aeromonas属中其他菌株黑色素合成途径 | 第117-123页 |
| 5.4 小结与讨论 | 第123-125页 |
| 研究总结和展望 | 第125-127页 |
| 参考文献 | 第127-137页 |
| 博士研究生期间科研成果 | 第137-138页 |
| 致谢 | 第138页 |
