| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 第一章 绪论 | 第9-21页 |
| 1.1 甾体化合物 | 第9-11页 |
| 1.1.1 甾体化合物的结构和分类 | 第9-10页 |
| 1.1.2 甾体类药物的概述 | 第10-11页 |
| 1.2 甾体化合物的微生物转化 | 第11-12页 |
| 1.2.1 甾体化合物微生物转化的发展历程 | 第11页 |
| 1.2.2 甾体化合物微生物转化的分类 | 第11-12页 |
| 1.3 微生物羟化甾体反应的机理研究 | 第12-15页 |
| 1.3.1 细胞色素P450的简介 | 第13页 |
| 1.3.2 细胞色素P450羟化反应机理 | 第13-14页 |
| 1.3.3 细胞色素P450电子传递系统的分类 | 第14页 |
| 1.3.4 真菌细胞色素P450的研究进展 | 第14-15页 |
| 1.4 甾体微生物羟化反应的影响因素 | 第15-17页 |
| 1.4.1 菌株的羟化能力 | 第15-16页 |
| 1.4.2 甾体底物的溶解度 | 第16-17页 |
| 1.4.3 其他因素 | 第17页 |
| 1.5 微生物羟化生成三羟基雄甾烯酮的研究 | 第17-18页 |
| 1.5.1 三羟基雄甾烯酮的简介 | 第17-18页 |
| 1.5.2 微生物羟化生成三羟基雄甾烯酮的研究进展 | 第18页 |
| 1.6 本课题的研究意义 | 第18-19页 |
| 1.7 本课题的主要研究内容 | 第19-21页 |
| 第二章 材料与方法 | 第21-31页 |
| 2.1 实验材料 | 第21-24页 |
| 2.1.1 菌种 | 第21页 |
| 2.1.2 引物 | 第21-22页 |
| 2.1.3 实验试剂材料 | 第22页 |
| 2.1.4 主要仪器与设备 | 第22-23页 |
| 2.1.5 培养基 | 第23页 |
| 2.1.6 主要溶液 | 第23-24页 |
| 2.2 实验方法 | 第24-31页 |
| 2.2.1 C. lini菌株的培养以及摇瓶转化DHEA | 第24页 |
| 2.2.2 原生质体ARTP诱变 | 第24页 |
| 2.2.3 Genome shuffling选育方法 | 第24-26页 |
| 2.2.4 优势高产菌株的评价 | 第26页 |
| 2.2.5 C. lini菌株RNA的提取与逆转录 | 第26页 |
| 2.2.6 C. lini菌株关键P450酶基因的q PCR验证 | 第26页 |
| 2.2.7 C. lini菌株关键P450酶基因的扩增和产物回收 | 第26-27页 |
| 2.2.8 重组质粒的构建 | 第27页 |
| 2.2.9 感受态细胞的制备与转化方法 | 第27页 |
| 2.2.10 重组毕赤酵母的构建与验证 | 第27-28页 |
| 2.2.11 重组毕赤酵母的诱导表达 | 第28页 |
| 2.2.12 重组毕赤酵母的活性检测 | 第28页 |
| 2.2.13 分析方法 | 第28-31页 |
| 第三章 结果与讨论 | 第31-49页 |
| 3.1 高效生物转化制备三羟基雄甾烯酮菌株的选育 | 第31-37页 |
| 3.1.1 原生质体ARTP诱变筛选优势高产菌株 | 第31-33页 |
| 3.1.2 Genome shuffling最适条件的确定 | 第33-36页 |
| 3.1.3 Genome shuffling技术选育三羟基雄甾烯酮高产菌株 | 第36-37页 |
| 3.2 优势融合菌株的评价及其羟化能力增强机制的初步探索 | 第37-42页 |
| 3.2.1. 优势融合菌株的评价 | 第37-41页 |
| 3.2.2 融合菌株羟化能力增强机制的初探 | 第41-42页 |
| 3.3 双羟化DHEA的关键P450酶的发现及功能验证 | 第42-49页 |
| 3.3.1 关键P450酶基因的扩增 | 第42-43页 |
| 3.3.2 关键P450酶的序列分析 | 第43-44页 |
| 3.3.3 重组表达质粒的构建与验证 | 第44-45页 |
| 3.3.4 阳性酵母转化子的筛选 | 第45页 |
| 3.3.5 目的蛋白的分析 | 第45-46页 |
| 3.3.6 重组酵母菌株甾体转化活性分析 | 第46-49页 |
| 主要结论与展望 | 第49-51页 |
| 主要结论 | 第49页 |
| 展望 | 第49-51页 |
| 致谢 | 第51-53页 |
| 参考文献 | 第53-59页 |
| 附录1：作者在攻读硕士学位期间发表的论文 | 第59-60页 |
| 附录2：P450酶基因cyp68jx序列 | 第60-61页 |
| 附录3：重组酵母转化产物MS谱图 | 第61页 |
