| 摘要 | 第3-4页 |
| Abstract | 第4页 |
| 1 引言 | 第13-26页 |
| 1.1 共轭亚油酸的结构 | 第13页 |
| 1.2 共轭亚油酸的功能 | 第13-14页 |
| 1.3 共轭亚油酸的来源 | 第14-17页 |
| 1.3.1 共轭亚油酸的天然来源 | 第14-16页 |
| 1.3.2 共轭亚油酸的化学合成 | 第16页 |
| 1.3.3 共轭亚油酸的内源合成 | 第16页 |
| 1.3.4 共轭亚油酸的微生物合成 | 第16-17页 |
| 1.4 共轭亚油酸检测方法 | 第17-19页 |
| 1.4.1 紫外检测法 | 第17页 |
| 1.4.2 银离子高效液相色谱法 | 第17-18页 |
| 1.4.3 气相色谱法 | 第18页 |
| 1.4.4 气质联用法 | 第18页 |
| 1.4.5 红外光谱检测法 | 第18页 |
| 1.4.6 核磁共振法 | 第18-19页 |
| 1.5 亚油酸异构酶 | 第19-23页 |
| 1.5.1 亚油酸异构酶简介 | 第19页 |
| 1.5.2 亚油酸异构酶基因表达的研究进展 | 第19-20页 |
| 1.5.3 亚油酸异构酶性质的研究 | 第20页 |
| 1.5.4 酶的固定化 | 第20-21页 |
| 1.5.5 微生物亚油酸异构酶作用机理 | 第21-23页 |
| 1.6 酶结构功能研究方法 | 第23-25页 |
| 1.6.1 蛋白晶体学对蛋白结构功能的研究 | 第23页 |
| 1.6.2 核磁共振技术对蛋白结构功能的研究 | 第23页 |
| 1.6.3 拉曼光谱法对蛋白结构功能的研究 | 第23-24页 |
| 1.6.4 X射线法 | 第24页 |
| 1.6.5 单颗粒冷冻电子显微镜技术 | 第24页 |
| 1.6.6 化学修饰法 | 第24页 |
| 1.6.7 突变法 | 第24-25页 |
| 1.7 本研究的目的和意义 | 第25-26页 |
| 2 试验材料与方法 | 第26-48页 |
| 2.1 试验材料 | 第26-31页 |
| 2.1.1 感受态细胞 | 第26页 |
| 2.1.2 主要试剂与试剂盒 | 第26-27页 |
| 2.1.3 主要仪器 | 第27-28页 |
| 2.1.4 培养基 | 第28页 |
| 2.1.5 主要溶液 | 第28-31页 |
| 2.2 试验方法 | 第31-48页 |
| 2.2.1 植物乳杆菌P-8基因组总DNA的提取 | 第31-32页 |
| 2.2.2 总DNA的检测 | 第32页 |
| 2.2.3 植物乳杆菌P-8亚油酸异构酶引物设计与PCR扩增 | 第32-33页 |
| 2.2.4 PCR产物的回收 | 第33-34页 |
| 2.2.5 目的片段的连接 | 第34页 |
| 2.2.6 pMD-19T- LAI的转化 | 第34页 |
| 2.2.7 阳性克隆的筛选 | 第34页 |
| 2.2.8 重组质粒pMD-19T-LAI的提取 | 第34-35页 |
| 2.2.9 亚油酸异构酶基因表达载体的构建 | 第35-37页 |
| 2.2.10 植物乳杆菌P-8亚油酸异构酶点突变体的构建 | 第37-41页 |
| 2.2.11 重组目的酶的诱导表达及纯化 | 第41-42页 |
| 2.2.12 LAI的质谱检测 | 第42-43页 |
| 2.2.13 目的酶含量的测定 | 第43-44页 |
| 2.2.14 SDS-PAGE检测酶的大小 | 第44-45页 |
| 2.2.15 亚油酸异构酶的活力测定 | 第45-48页 |
| 3 结果与分析 | 第48-70页 |
| 3.1 植物乳杆菌P-8总DNA的提取 | 第48-49页 |
| 3.2 LAI的扩增 | 第49-50页 |
| 3.3 pET-28a(+)质粒的提取 | 第50页 |
| 3.4 重组表达载体的构建 | 第50-53页 |
| 3.4.1 菌落PCR的鉴定 | 第51-52页 |
| 3.4.2 重组质粒pET28a-LAI的双酶切鉴定 | 第52页 |
| 3.4.3 重组质粒测序 | 第52-53页 |
| 3.5 点突变质粒的构建 | 第53-55页 |
| 3.5.1 点突变质粒的PCR扩增 | 第53-54页 |
| 3.5.2 点突变质粒的序列比对 | 第54-55页 |
| 3.6 目的蛋白诱导表达纯化及表达产物的分析 | 第55-56页 |
| 3.7 目的蛋白的质谱检测 | 第56-57页 |
| 3.8 突变体蛋白诱导表达纯化及表达产物的分析 | 第57-60页 |
| 3.9 纯化的LAI及其突变体的浓度测定 | 第60-61页 |
| 3.9.1 标准曲线绘制 | 第60-61页 |
| 3.9.2 LAI及其各点突变体蛋白含量的测定 | 第61页 |
| 3.10 标准样品的色谱图 | 第61-62页 |
| 3.11 LAI酶活力测定 | 第62-70页 |
| 3.11.1 内标法标准曲线的绘制 | 第62-63页 |
| 3.11.2 底物浓度与LAI酶促反应速度的影响 | 第63-64页 |
| 3.11.3 LAI的用量与LAI酶促反应速度的影响 | 第64页 |
| 3.11.4 pH值与LAI酶促反应速度的影响 | 第64-65页 |
| 3.11.5 温度与LAI酶促反应速度的影响 | 第65-66页 |
| 3.11.6 金属离子对亚油酸异构酶酶促反应速度的影响 | 第66-67页 |
| 3.11.7 亚油酸异构酶的动力学参数的确立 | 第67-68页 |
| 3.11.8 LAI及其各突变体的活力分析 | 第68-70页 |
| 4 讨论 | 第70-72页 |
| 4.1 重组质粒的构建 | 第70页 |
| 4.2 蛋白的表达及纯化 | 第70页 |
| 4.3 酶活性的测定 | 第70-72页 |
| 5 结论 | 第72-73页 |
| 致谢 | 第73-74页 |
| 参考文献 | 第74-81页 |
| 附录 | 第81-84页 |
| 作者简介 | 第84页 |
