| 摘要 | 第1-6页 |
| ABSTRACT | 第6-12页 |
| 第一章 文献综述 | 第12-28页 |
| ·纤维素资源与利用现状 | 第12-13页 |
| ·纤维素酶 | 第13-19页 |
| ·纤维素酶的类型 | 第13-14页 |
| ·纤维素酶的研究历史 | 第14-15页 |
| ·纤维素酶的作用机理 | 第15-16页 |
| ·动物纤维素酶的研究 | 第16-18页 |
| ·纤维素酶的应用 | 第18-19页 |
| ·毕赤酵母表达系统研究进展 | 第19-25页 |
| ·毕赤酵母密码子偏好性 | 第19-20页 |
| ·毕赤酵母的分子生物学特征 | 第20-23页 |
| ·转化与整合 | 第23-25页 |
| ·表达产物的翻译后修饰 | 第25页 |
| ·本研究的研究背景和意义 | 第25-26页 |
| ·本课题的研究内容 | 第26-28页 |
| 第二章 福寿螺纤维素酶cDNA的克隆及其结构分析 | 第28-41页 |
| ·引言 | 第28页 |
| ·实验材料 | 第28-30页 |
| ·实验仪器 | 第28-29页 |
| ·实验试剂 | 第29页 |
| ·供试生物、菌株及培养基 | 第29-30页 |
| ·实验方法 | 第30-35页 |
| ·引物的设计与合成 | 第30页 |
| ·福寿螺胃组织RNA分离及反转录 | 第30-31页 |
| ·目的基因的PCR扩增 | 第31页 |
| ·PCR产物电泳检测及胶回收纯化 | 第31-32页 |
| ·目的片段和pMD 18-T Vector的连接 | 第32页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备及重组质粒的转化 | 第32-33页 |
| ·转化子的快速筛选和初步鉴定——质粒快检 | 第33-34页 |
| ·阳性克隆的PCR鉴定 | 第34页 |
| ·序列测定 | 第34页 |
| ·基因解析 | 第34页 |
| ·表达产物的糖基化位点预测 | 第34-35页 |
| ·结果与讨论 | 第35-40页 |
| ·电泳检测RT-PCR结果 | 第35-36页 |
| ·RT-PCR产物的回收 | 第36页 |
| ·目的片段的连接与转化 | 第36-37页 |
| ·序列测定 | 第37-38页 |
| ·基因解析 | 第38页 |
| ·糖基化位点的分析结果 | 第38-40页 |
| ·本章小结 | 第40-41页 |
| 第三章 pPIC9K-SXYN载体的构建及在毕赤酵母中的表达 | 第41-65页 |
| ·引言 | 第41页 |
| ·表达载体构建示意图 | 第41-42页 |
| ·实验材料 | 第42-44页 |
| ·实验试剂 | 第42-43页 |
| ·实验仪器 | 第43页 |
| ·质粒、菌株及培养基 | 第43-44页 |
| ·实验方法 | 第44-53页 |
| ·质粒的提取及检测 | 第44页 |
| ·引物的设计与合成 | 第44页 |
| ·PCR反应 | 第44-45页 |
| ·PCR产物的浓缩 | 第45-46页 |
| ·经纯化的PCR产物的酶切 | 第46-47页 |
| ·酶切产物纯化 | 第47页 |
| ·目的基因与载体的连接 | 第47页 |
| ·感受态细胞的制备 | 第47-48页 |
| ·连接产物的转化 | 第48页 |
| ·毕赤酵母的电转化 | 第48页 |
| ·E.coli DH 5α转化子的筛选与鉴定 | 第48-49页 |
| ·阳性克隆的基因测序与保存 | 第49页 |
| ·毕赤酵母转化子的筛选与鉴定 | 第49-50页 |
| ·选择相同表型的高拷贝阳性克隆进行诱导表达 | 第50页 |
| ·表达产物的酶活测定 | 第50-51页 |
| ·表达条件的进一步优化 | 第51-52页 |
| ·表达产物的SDS-PAGE电泳 | 第52-53页 |
| ·目的蛋白部分酶学特性的分析 | 第53页 |
| ·结果与讨论 | 第53-63页 |
| ·含目的基因的质粒及载体pPIC9K的提取及检测 | 第53-54页 |
| ·目的基因的扩增 | 第54页 |
| ·目的基因连接到pMD 18-T载体上后转化验证 | 第54-55页 |
| ·提取“pMD 18-T-SXYN质粒”进行双酶切及酶切产物的纯化结果 | 第55页 |
| ·目的基因与表达载体的连接、转化子的筛选与鉴定 | 第55-56页 |
| ·阳性克隆的基因测序 | 第56-57页 |
| ·重组质粒pPIC9K的大量提取及单酶切验证 | 第57-58页 |
| ·毕赤酵母的电转化 | 第58页 |
| ·含高拷贝阳性转化子的初步筛选 | 第58-59页 |
| ·阳性转化子及空载体转化子的PCR快检 | 第59-60页 |
| ·重组体诱导表达后的活性检测 | 第60-61页 |
| ·诱导表达条件的进一步优化 | 第61-62页 |
| ·SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达 | 第62-63页 |
| ·pH对CMCase酶活的影响 | 第63页 |
| ·不同反应温度对 CMCase 酶活的影响 | 第63页 |
| ·本章小结 | 第63-65页 |
| 第四章 总结与展望 | 第65-68页 |
| ·全文总结 | 第65页 |
| ·本课题还存在的问题及解决思路 | 第65-68页 |
| 参考文献 | 第68-73页 |
| 致谢 | 第73-74页 |
| 在读期间发表论文 | 第74页 |