| 摘要 | 第1-6页 |
| Abstract | 第6-8页 |
| 缩略词表 | 第8-14页 |
| 第一章 文献综述 | 第14-35页 |
| 1 柑橘抗溃疡病育种研究现状 | 第14-20页 |
| ·柑橘溃疡病发生历史及病害分布 | 第14-15页 |
| ·病菌特性及发病症状 | 第15-16页 |
| ·柑橘溃疡病病菌分类鉴定研究 | 第16-17页 |
| ·柑橘溃疡病病菌基因组研究 | 第17-18页 |
| ·柑橘溃疡病病菌致病机理研究 | 第18-20页 |
| ·柑橘溃疡病病菌pthA基因 | 第18-19页 |
| ·柑橘溃疡病病菌pthA与宿主相互作用的可能机理 | 第19-20页 |
| 2 植物抗细菌性病害研究进展 | 第20-27页 |
| ·病原菌致病相关基因 | 第21-23页 |
| ·毒性基因 | 第21-22页 |
| ·无毒基因 | 第22-23页 |
| ·决定寄主范围的基因 | 第23页 |
| ·植物抗细菌病害基因工程的研究 | 第23-27页 |
| ·阻断病原细菌的致病途径 | 第23页 |
| ·降解病原菌致病毒素 | 第23-24页 |
| ·导入抗病基因 | 第24-25页 |
| ·单克隆抗体的应用潜力 | 第25页 |
| ·病原菌无毒基因的利用 | 第25-26页 |
| ·增强激发子的产生 | 第26页 |
| ·利用RNAi干扰 | 第26-27页 |
| 3 植物抗体工程研究进展 | 第27-33页 |
| ·抗体基因的结构及特征 | 第27-28页 |
| ·基因工程抗体的研究进展 | 第28-31页 |
| ·嵌合抗体 | 第28-29页 |
| ·重构抗体 | 第29页 |
| ·单链抗体 | 第29-30页 |
| ·抗体基因组文库 | 第30-31页 |
| ·植物抗体及其应用 | 第31-33页 |
| ·提高植物抗病虫性 | 第31-32页 |
| ·调控植物代谢 | 第32-33页 |
| 4 开展本研究的目的与意义 | 第33-34页 |
| 5 技术路线 | 第34-35页 |
| 第二章 柑橘溃疡病菌的分离和检测 | 第35-45页 |
| 1 材料与方法 | 第35-39页 |
| ·试验材料 | 第35页 |
| ·方法 | 第35-39页 |
| ·引物设计 | 第35页 |
| ·样品准备 | 第35-37页 |
| ·针刺接种试验 | 第37页 |
| ·PCR检测 | 第37-38页 |
| ·JYF5/JYR5 PCR产物克隆测序 | 第38-39页 |
| 2 结果与分析 | 第39-41页 |
| ·菌种分离 | 第39页 |
| ·针刺离体接种鉴定 | 第39-40页 |
| ·PCR检测结果 | 第40-41页 |
| ·JYF5/JYR5扩增产物克隆测序结果 | 第41页 |
| 3 讨论 | 第41-44页 |
| 4 小结 | 第44-45页 |
| 第三章 致病基因pthA的克隆及序列分析 | 第45-57页 |
| 1 材料与方法 | 第45-49页 |
| ·材料 | 第45页 |
| ·方法 | 第45-49页 |
| ·引物设计 | 第45-46页 |
| ·溃疡病病菌质粒提取 | 第46页 |
| ·pthA基因5′和3′端序列PCR扩增 | 第46-47页 |
| ·pthA基因5′和3′端PCR扩增产物的回收纯化 | 第47页 |
| ·pthA基因5′和3′端PCR扩增产物克隆 | 第47页 |
| ·pthA基因全长PCR扩增 | 第47-48页 |
| ·pthA基因long-PCR扩增产物的回收纯化 | 第48页 |
| ·pthA巢式PCR(net-PCR)扩增 | 第48页 |
| ·pthA基因巢式PCR扩增产物回收片段双酶切 | 第48页 |
| ·植物表达载体pBI121质粒提取及双酶切 | 第48页 |
| ·pthA基因与载体连接转化 | 第48-49页 |
| ·菌落PCR扩增鉴定与摇菌培养 | 第49页 |
| ·生物信息学分析 | 第49页 |
| 2 结果与分析 | 第49-55页 |
| ·pthA基因5′和3′端序列克隆 | 第49-50页 |
| ·pthA基因5′和3′端序列分析 | 第50-51页 |
| ·pthA基因全长的克隆 | 第51-52页 |
| ·pthA′序列分析 | 第52-55页 |
| 3 讨论 | 第55页 |
| 4 小结 | 第55-57页 |
| 第四章 pthA-nls正反义基因构建及对甜橙遗传转化的研究 | 第57-75页 |
| 第一节 正义基因pthA-nls植物表达载体构建及对甜橙遗传转化的研究 | 第58-71页 |
| 1 材料与方法 | 第58-65页 |
| ·材料 | 第58页 |
| ·主要培养基配方 | 第58页 |
| ·pthA-nls正义基因植物表达载体构建 | 第58-60页 |
| ·核定位信号(NLSs)序列的扩增、克隆和测序 | 第58-59页 |
| ·pthA-nls质粒转化农杆菌 | 第59-60页 |
| ·pthA-nls对甜橙的遗传转化 | 第60-61页 |
| ·受体材料的获得 | 第60页 |
| ·对照材料芽的诱导 | 第60页 |
| ·外植体转化处理 | 第60页 |
| ·抗性芽的诱导 | 第60-61页 |
| ·不定芽微芽嫁接成苗 | 第61页 |
| ·温室二次嫁接 | 第61页 |
| ·转pthA-nls甜橙PCR鉴定 | 第61-62页 |
| ·基因组DNA的提取 | 第61-62页 |
| ·转化再生植株的PCR检测 | 第62页 |
| ·转pthA-nls基因甜橙外源基因RT-PCR表达分析 | 第62-63页 |
| ·RNA的提取 | 第62页 |
| ·RT-PCR反应 | 第62-63页 |
| ·转pthA-nls甜橙外源基因southern杂交分析 | 第63-65页 |
| ·总DNA提取 | 第63页 |
| ·探针的制备 | 第63页 |
| ·总DNA的限制酶消化 | 第63页 |
| ·总DNA电泳 | 第63页 |
| ·转膜 | 第63-64页 |
| ·紫外交联 | 第64页 |
| ·预杂交和杂交 | 第64页 |
| ·洗膜 | 第64-65页 |
| ·显影 | 第65页 |
| ·转基因植株抗性试验 | 第65页 |
| 2 结果与分析 | 第65-70页 |
| ·pthA-nls的克隆 | 第65-66页 |
| ·pthA-nls基因植物表达载体的构建 | 第66-67页 |
| ·pthA-nls对甜橙的遗传转化结果 | 第67页 |
| ·转pthA-nls基因甜橙外源基因表达分析 | 第67-68页 |
| ·总RNA提取 | 第67页 |
| ·外源基因pthA-nls表达分析 | 第67-68页 |
| ·转pthA-nls甜橙外源基因southern杂交分析 | 第68页 |
| ·转pthA-nls植株抗性试验 | 第68-70页 |
| 3 讨论 | 第70-71页 |
| 第二节 反义基因pthA-a-nls植物表达载体构建及对甜橙遗传转化的研究 | 第71-75页 |
| 1 材料与方法 | 第71-72页 |
| ·材料 | 第71页 |
| ·核定位信号(NLS)序列的扩增、克隆和测序 | 第71-72页 |
| ·反义基因pthA-a-nls对甜橙的遗传转化和鉴定 | 第72页 |
| 2 结果与分析 | 第72-74页 |
| ·反义基因pthA-a-nls的构建 | 第72-73页 |
| ·pthA-a-nls对甜橙的遗传转化结果 | 第73-74页 |
| ·转pthA-a-nls植株抗性试验 | 第74页 |
| 3 小结 | 第74-75页 |
| 第五章 PthA-NLS抗血清制备及其对柑橘溃疡病的抑制作用 | 第75-86页 |
| 1 材料与方法 | 第75-79页 |
| ·材料 | 第75页 |
| ·核定位信号(NLSs)序列的扩增、克隆和测序 | 第75-76页 |
| ·重组多肽的诱导表达 | 第76页 |
| ·重组多肽的纯化 | 第76页 |
| ·鼠抗PthA-NLS血清的制备 | 第76页 |
| ·抗血清的效价测定 | 第76-79页 |
| ·间接ELISA法检测 | 第76-77页 |
| ·抗血清特异性Western Blotting检测 | 第77-79页 |
| ·抗血清对病原菌生长和柑橘溃疡病发病的抑制作用的测试 | 第79页 |
| 2 结果与分析 | 第79-83页 |
| ·致病基因pthA核定位信号序列NLSs的PCR扩增 | 第79-80页 |
| ·NLSs序列的克隆与测序 | 第80-81页 |
| ·重组PthA-NLS多肽的原核表达及其纯化 | 第81-82页 |
| ·鼠抗PthA-NLS血清的制备与特异性鉴定 | 第82-83页 |
| ·抗血清对柑橘溃疡病病菌生长和病害发生的抑制效果 | 第83页 |
| 3 讨论 | 第83-84页 |
| 4 小结 | 第84-86页 |
| 第六章 抗PthA-NLS多肽单克隆抗体的制备及ScFv基因构建 | 第86-98页 |
| 第一节 抗PthA-NLS多肽单克隆抗体的制备 | 第86-92页 |
| 1 材料与方法 | 第86-89页 |
| ·材料与试剂 | 第86页 |
| ·技术路线 | 第86-87页 |
| ·方法 | 第87-89页 |
| ·脾细胞准备 | 第87页 |
| ·融合过程 | 第87-88页 |
| ·有限稀释法建立克隆株 | 第88-89页 |
| ·杂交瘤细胞的大量繁殖 | 第89页 |
| ·单克隆抗体的鉴定 | 第89页 |
| ·单克隆抗体的类和亚类鉴定 | 第89页 |
| 2 结果与分析 | 第89-91页 |
| ·分泌抗PthA-NLS单克隆抗体阳性杂交瘤细胞的获得 | 第89-90页 |
| ·Western Blotting鉴定单克隆抗体 | 第90-91页 |
| ·单克隆抗体的类和亚类鉴定 | 第91页 |
| 3 讨论 | 第91页 |
| 4 小结 | 第91-92页 |
| 第二节 抗PthA-NLS单克隆抗体ScFv基因的克隆及原核表达 | 第92-98页 |
| 1 材料与方法 | 第92-94页 |
| ·材料 | 第92页 |
| ·方法 | 第92-94页 |
| ·引物设计 | 第92-93页 |
| ·细胞总RNA提取 | 第93页 |
| ·抗体可变区基因的扩增 | 第93页 |
| ·ScFv基因的构建 | 第93-94页 |
| ·ScFv的克隆及原核表达 | 第94页 |
| 2 结果与分析 | 第94-96页 |
| 3 讨论 | 第96-97页 |
| 4 小结 | 第97-98页 |
| 第七章 单链抗体基因ScFv对甜橙的遗传转化 | 第98-107页 |
| 1 材料与方法 | 第99-100页 |
| ·材料 | 第99页 |
| ·方法 | 第99-100页 |
| ·引物设计 | 第99页 |
| ·ScFv植物表达载体构建 | 第99页 |
| ·ScFv基因转化甜橙 | 第99-100页 |
| ·转ScFv基因甜橙PCR分子鉴定 | 第100页 |
| ·转ScFv基因甜橙RT-PCR表达分析 | 第100页 |
| ·转ScFv基因甜橙离体接种抗性试验 | 第100页 |
| 2 结果与分析 | 第100-104页 |
| ·ScFv基因植物表达载体构建 | 第100-102页 |
| ·ScFv对甜橙的遗传转化结果 | 第102-103页 |
| ·转ScFv基因甜橙ScFv基因表达分析 | 第103页 |
| ·转ScFv基因甜橙离体接种抗性试验 | 第103-104页 |
| 3 讨论 | 第104-106页 |
| 4 小结 | 第106-107页 |
| 结论 | 第107-109页 |
| 论文创新点 | 第109-110页 |
| 下一步工作设想 | 第110-111页 |
| 参考文献 | 第111-124页 |
| 致谢 | 第124-125页 |
| 个人简历 | 第125-127页 |
