| 目录 | 第1-12页 |
| 中文摘要 | 第12-18页 |
| ABSTRACT | 第18-27页 |
| 符号说明 | 第27-29页 |
| 前言 | 第29-38页 |
| 总体技术路线 | 第38-39页 |
| 第一部分 肝癌细胞悬浮生长模型的建立与Synoikis-like肝癌细胞 | 第39-74页 |
| 技术路线Ⅰ | 第39-40页 |
| 实验材料 | 第40-42页 |
| 1.试剂 | 第40-41页 |
| 2.仪器 | 第41-42页 |
| 第一章 细胞悬浮生长模型的建立和Synoikis-like生存状态肝癌细胞的形态特征 | 第42-49页 |
| 第一节 细胞悬浮生长模型的建立 | 第42-44页 |
| 1.方法 | 第43-44页 |
| ·PolyHEMA包被板的制备 | 第43页 |
| ·细胞悬浮生长模型的建立 | 第43-44页 |
| ·细胞培养及制备悬浮的肝癌细胞 | 第43页 |
| ·通过台盼蓝染色观察细胞的活性 | 第43-44页 |
| 2.结果 | 第44页 |
| 第二节 悬浮培养的肝癌细胞的分期及Synoikis-like细胞的形态学特征 | 第44-48页 |
| ·方法 | 第44-45页 |
| ·悬浮培养的肝癌细胞的分期 | 第44-45页 |
| ·Synoikis-like肝癌细胞的生物学染色观察 | 第45页 |
| ·Synoikis-like肝癌细胞的电镜观察 | 第45页 |
| ·结果 | 第45-48页 |
| ·悬浮培养的肝癌细胞的分期 | 第45-46页 |
| ·Synoikis-like肝癌细胞的荧光染色观察 | 第46-47页 |
| ·Synoikis-like肝癌细胞的电镜观察 | 第47-48页 |
| 第一章小结 | 第48-49页 |
| 第二章 肝癌细胞通过Synoikis-like的方式抵抗失巢凋亡的生物学特征 | 第49-53页 |
| 1 方法 | 第49-51页 |
| ·Synoikis-like肝癌细胞形态学的变化 | 第49页 |
| ·EGTA法脱钙实验对成熟期肝癌细胞的影响 | 第49页 |
| ·Synoikis-like细胞生长曲线的变化 | 第49-50页 |
| ·Synoikis-like细胞的细胞周期变化 | 第50页 |
| ·Synoikis-like肝癌细胞凋亡率的检测 | 第50-51页 |
| ·细胞转移过程中到达异位再次贴壁生长的动态模拟 | 第51页 |
| ·多种肿瘤细胞系在抵抗失巢凋亡过程中生存状态的检测 | 第51页 |
| 2 结果 | 第51-53页 |
| ·Synoikis-like肝癌细胞形态学的变化 | 第51-52页 |
| ·Synoikis-like肝癌细胞抵抗EGTA导致的脱钙 | 第52页 |
| ·Synoikis-like肝癌细胞生长曲线的变化 | 第52页 |
| ·Synoikis-like肝癌细胞未见凋亡增加 | 第52页 |
| ·Synoikis-like肝癌细胞的细胞周期阻滞 | 第52-53页 |
| ·细胞转移过程中到达异位再次贴壁生长的动态模拟 | 第53页 |
| ·多种肿瘤细胞系通过Synoikis-like生存方式抵抗失巢凋亡 | 第53页 |
| 第二章小结 | 第53页 |
| 第三章 Synoikis-like肝癌细胞敏感性的检测 | 第53-56页 |
| 1 方法 | 第53-55页 |
| ·Synoikis-like肝癌细胞对化疗药敏感性检测 | 第53-54页 |
| ·Synoikis-like肝癌细胞对凋亡诱导剂的敏感性检测 | 第54页 |
| ·Synoikis-like肝癌细胞对紫外线的敏感性检测 | 第54页 |
| ·Synoikis-like肝癌细胞生存状态与HBpreS2的转染 | 第54-55页 |
| 2 结果 | 第55-56页 |
| ·Synoikis-like肝癌细胞对化疗药敏感性降低 | 第55页 |
| ·Synoikis-like肝癌细胞对凋亡诱导剂的敏感性降低 | 第55页 |
| ·Synoikis-like肝癌细胞对紫外线的敏感性降低 | 第55页 |
| ·Synoikis-like肝癌细胞生存状态不受HBpreS2的表达影响 | 第55-56页 |
| 第三章小结 | 第56页 |
| 第一部分讨论 | 第56-62页 |
| 第一部分总结 | 第62-63页 |
| 第一部分附图 | 第63-74页 |
| 第二部分 Synoikis-like肝癌细胞的分子机制 | 第74-123页 |
| 技术路线Ⅱ | 第74-75页 |
| 1.实验材料 | 第75-78页 |
| ·质粒,细胞系与菌株 | 第75页 |
| ·主要试剂与配制 | 第75-77页 |
| ·主要实验仪器 | 第77-78页 |
| 2.常用实验方法 | 第78-83页 |
| ·RT-PCR与Real-time PCR | 第78-80页 |
| ·Western | 第80-82页 |
| ·siRNA载体DNA的瞬时转染 | 第82-83页 |
| ·统计分析 | 第83页 |
| 第四章 利用基因芯片对Synoikis-like肝癌细胞关键分子的筛选 | 第83-85页 |
| 1 方法 | 第83-84页 |
| ·悬浮和贴壁细胞RNA的提取和基因芯片的检测 | 第83页 |
| ·芯片图像的采集与数据分析 | 第83-84页 |
| ·基因芯片结果分析和筛选 | 第84页 |
| ·Real-time PCR对目标基因表达的验证 | 第84页 |
| 2 结果 | 第84-85页 |
| ·基因芯片的结果与分析 | 第84-85页 |
| ·基因芯片结果的统计学分析 | 第84页 |
| ·基因芯片各通路分子的表达谱变化 | 第84-85页 |
| ·差异基因Real-time PCR的验证结果与基因芯片相一致 | 第85页 |
| 第四章小结 | 第85页 |
| 第五章 Synoikis-like肝癌细胞的信号传导通路 | 第85-89页 |
| 第一节 Synoikis-like肝癌细胞的凋亡和凋亡调节通路 | 第85-87页 |
| ·方法 | 第86-87页 |
| ·细胞培养 | 第86页 |
| ·半定量RT-PCR检测凋亡通路分子在Synoikis-like肝癌细胞的表达 | 第86页 |
| ·Western检测XIAP,FLIP的表达 | 第86页 |
| ·流式细胞术检测XIAP的表达 | 第86-87页 |
| ·结果 | 第87页 |
| ·凋亡通路分子在Synoikis-like肝癌细胞无显著变化 | 第87页 |
| ·凋亡调节分子FLIP,XIAP在Synoikis-like肝癌细胞中表达强度增加 | 第87页 |
| 第二节 Synoikis-like肝癌细胞的生存通路 | 第87-89页 |
| ·方法 | 第87-89页 |
| ·细胞培养 | 第87-88页 |
| ·半定量RT-PCR与实时定量PCR检测BDNF/TrkB在Synoikis-like肝癌细胞的表达 | 第88页 |
| ·流式细胞术检测细胞膜蛋白TrkB的表达 | 第88页 |
| ·BDNF/TrkB通路对Synoikis-like肝癌细胞的作用效应 | 第88-89页 |
| ·结果 | 第89页 |
| ·BDNF/TrkB在Synoikis-like肝癌细胞表达上调 | 第89页 |
| ·BDNF/TrkB通路能够促进Synoikis-like肝癌细胞发生增殖 | 第89页 |
| 第五章小结 | 第89页 |
| 第六章 Synoikis-like肝癌细胞凋亡抑制基因BCL2L2的研究 | 第89-96页 |
| 1 方法 | 第90-94页 |
| ·BCL2L2-SiRNA的构建 | 第90-93页 |
| ·siRNA基因片段的合成和PCR补齐反应 | 第90-91页 |
| ·亚克隆的制备 | 第91-92页 |
| ·siRNA片段和亚克隆的连接 | 第92页 |
| ·菌落PCR鉴定并筛选阳性克隆——siRNA载体的筛选 | 第92-93页 |
| ·BCL2L2siRNA载体的转染 | 第93页 |
| ·Real-time PCR检测BCL2L2基因的表达 | 第93页 |
| ·MAPK和PI3K/Akt通路对Synoikis-like肝癌细胞的影响 | 第93页 |
| ·Wortmannin阻断PI3K/AKT通路对BCL2L2表达的影响 | 第93-94页 |
| ·BCL2L2表达的下调对Synoikis-like肝癌细胞生物学特征的影响 | 第94页 |
| 2 结果 | 第94-96页 |
| ·siRNA表达载体pSilencerBCL2L2的构建 | 第94-95页 |
| ·siRNA表达载体有效抑制BCL2L2的表达 | 第95页 |
| ·MAPK和PI3K/Akt通路对Synoikis-like肝癌细胞的影响 | 第95页 |
| ·BCL2L2的表达依赖于PI3K/AKT通路 | 第95页 |
| ·BCL2L2表达的下调增加Synoikis-like肝癌细胞的药物敏感性 | 第95-96页 |
| 第六章小结 | 第96页 |
| 第二部分讨论 | 第96-103页 |
| 第二部分总结 | 第103-104页 |
| 第二部分附图 | 第104-120页 |
| 第二部分附表 | 第120-123页 |
| 参考文献 | 第123-131页 |
| 致谢 | 第131-132页 |
| 博士在读期间发表的论文与专利 | 第132-133页 |
| 博士论文英文部分 | 第133-161页 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 | 第161页 |
