| 摘要 | 第1-4页 |
| Abstract | 第4-6页 |
| 目录 | 第6-9页 |
| 第1章 绪论 | 第9-16页 |
| ·燃料乙醇研究背景及意义 | 第9-10页 |
| ·燃料乙醇发展现状及前景 | 第9页 |
| ·燃料乙醇生产原料问题 | 第9-10页 |
| ·木薯乙醇重要性研究 | 第10-12页 |
| ·木薯成分、特性 | 第10-11页 |
| ·木薯作为乙醇生产原料的优势 | 第11-12页 |
| ·木薯发酵工艺存在问题 | 第12-14页 |
| ·传统木薯发酵工序复杂 | 第12页 |
| ·能耗大、成本高 | 第12-13页 |
| ·酶制剂的添加 | 第13-14页 |
| ·本课题的研究目的和意义 | 第14页 |
| ·本文的研究概况 | 第14-16页 |
| 第2章 α-淀粉酶与糖化酶基因克隆及其在酿酒酵母中共表达 | 第16-36页 |
| ·导言 | 第16页 |
| ·实验材料 | 第16-18页 |
| ·菌株与质粒 | 第16页 |
| ·培养基与培养方法 | 第16-17页 |
| ·酶与试剂 | 第17页 |
| ·所需试剂配制 | 第17-18页 |
| ·主要仪器与设备 | 第18页 |
| ·实验方法 | 第18-26页 |
| ·米曲霉、黑曲霉的cDNA制备 | 第18-19页 |
| ·米曲霉、黑曲霉的RNA提取 | 第18-19页 |
| ·RNA的反转录 | 第19页 |
| ·α-淀粉酶与糖化酶基因的PCR扩增 | 第19-20页 |
| ·引物设计与合成 | 第19页 |
| ·PCR扩增 | 第19-20页 |
| ·扩增产物的纯化 | 第20页 |
| ·目的基因A/T克隆及转化 | 第20-22页 |
| ·目的基因与T vector的连接反应 | 第20页 |
| ·连接产物转化E. coli JM109感受态细胞 | 第20-21页 |
| ·转化子的菌落PCR鉴定 | 第21页 |
| ·质粒DNA的提取 | 第21-22页 |
| ·重组质粒的酶切鉴定 | 第22页 |
| ·DNA测序与序列分析 | 第22页 |
| ·淀粉酶双基因共表达质粒的构建 | 第22-24页 |
| ·单个淀粉酶基因与表达载体pScIKP的连接 | 第22-23页 |
| ·双基因表达质粒的构建 | 第23-24页 |
| ·酿酒酵母的电转化 | 第24-25页 |
| ·酿酒酵母电转化感受态的制备 | 第24-25页 |
| ·线性化DNA的制备 | 第25页 |
| ·电击转化 | 第25页 |
| ·转化子鉴定与重组子筛选 | 第25-26页 |
| ·菌落PCR法鉴定转化子 | 第25-26页 |
| ·碘淀粉水解圈法筛选重组子 | 第26页 |
| ·重组酿酒酵母培养上清的 SDS-PAGE | 第26页 |
| ·结果与分析 | 第26-35页 |
| ·米曲霉与黑曲霉cDNA的获得 | 第26-27页 |
| ·目的基因的克隆 | 第27-32页 |
| ·双基因重组表达质粒的构建与酶切鉴定 | 第32页 |
| ·重组酵母菌株的获得 | 第32-33页 |
| ·碘淀粉水解圈与SDS-PAGE结果 | 第33-35页 |
| ·讨论 | 第35-36页 |
| 第3章 重组酿酒酵母酶活分析与混合酶配比研究 | 第36-42页 |
| ·导言 | 第36页 |
| ·实验材料 | 第36-37页 |
| ·所需试剂配制 | 第36-37页 |
| ·商业化淀粉酶制剂 | 第37页 |
| ·主要仪器与设备 | 第37页 |
| ·实验方法 | 第37-40页 |
| ·重组酵母培养上清的液化酶与糖化酶活测定 | 第37-38页 |
| ·混合淀粉酶配比试验 | 第38-40页 |
| ·绘制标准曲线 | 第39-40页 |
| ·测定方法 | 第40页 |
| ·结果与分析 | 第40-41页 |
| ·重组液化酶与糖化酶酶活 | 第40页 |
| ·酶活配比实验结果 | 第40-41页 |
| ·葡萄糖标准曲线的绘制 | 第40页 |
| ·混合淀粉酶配比试验结果 | 第40-41页 |
| ·讨论 | 第41-42页 |
| 第4章 双基因多表达盒串联重组酵母的构建与酶活分析 | 第42-49页 |
| ·导言 | 第42页 |
| ·实验材料 | 第42页 |
| ·菌株与质粒 | 第42页 |
| ·工具酶与试剂 | 第42页 |
| ·主要仪器与设备 | 第42页 |
| ·实验方法 | 第42-44页 |
| ·ga 基因内Nhe I酶切位点的消除 | 第42-43页 |
| ·mga 基因的T-vector克隆与测序 | 第43页 |
| ·双基因多表达盒串联质粒的构建 | 第43页 |
| ·不同淀粉酶基因个数比例重组酵母的淀粉水解能力分析 | 第43-44页 |
| ·结果与分析 | 第44-47页 |
| ·Nhe I酶切位点的消除 | 第44-45页 |
| ·双基因多表达盒串联质粒的获得 | 第45-47页 |
| ·不同淀粉酶基因个数比例重组酵母的淀粉水解能力分析 | 第47页 |
| ·讨论 | 第47-49页 |
| 第5章 高淀粉酶活性重组菌株的筛选、酶学性质及发酵研究 | 第49-63页 |
| ·导言 | 第49页 |
| ·实验材料 | 第49-50页 |
| ·菌株 | 第49页 |
| ·培养基 | 第49页 |
| ·试剂配置 | 第49页 |
| ·木薯粉 | 第49-50页 |
| ·主要仪器与设备 | 第50页 |
| ·实验方法 | 第50-54页 |
| ·高分泌酶活性重组酵母菌株的筛选及性能测定 | 第50-51页 |
| ·通过多次电转及碘淀粉水解圈筛选高分泌酶活菌株 | 第50页 |
| ·工程菌株生物量及生长曲线的测定 | 第50-51页 |
| ·重组淀粉酶的酶学性质研究 | 第51页 |
| ·重组菌遗传稳定性检测 | 第51页 |
| ·摇瓶发酵条件研究 | 第51-53页 |
| ·种子酵母生长状态检测及细胞计数 | 第51-52页 |
| ·发酵培养基组成优化 | 第52页 |
| ·发酵条件正交试验 | 第52-53页 |
| ·发酵液乙醇、还原糖、残淀粉浓度等的测定 | 第53页 |
| ·小罐发酵试验 | 第53-54页 |
| ·结果与分析 | 第54-61页 |
| ·高淀粉酶活性重组酵母菌株的筛选及性能测定 | 第54-57页 |
| ·分泌高淀粉酶活性重组酵母菌株的筛选 | 第54页 |
| ·生物量 | 第54-55页 |
| ·重组酶酶学性质分析 | 第55-57页 |
| ·重组菌遗传稳定性检测 | 第57页 |
| ·摇瓶发酵条件建立 | 第57-61页 |
| ·种子酵母的制备 | 第57-58页 |
| ·发酵培养基组成确定 | 第58-59页 |
| ·发酵条件建立 | 第59-60页 |
| ·小罐发酵试验结果 | 第60-61页 |
| ·讨论 | 第61-63页 |
| 全文总结与展望 | 第63-65页 |
| 参考文献 | 第65-69页 |
| 附录 | 第69-73页 |
| 缩略语 | 第73-74页 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 | 第74-75页 |
| 致谢 | 第75页 |
