| 致谢 | 第1-10页 |
| 摘要 | 第10-12页 |
| Abstract | 第12-14页 |
| 第一部分：综述 利用基因工程技术改良作物蛋白质品质的研究进展 | 第14-31页 |
| 摘要 | 第14-16页 |
| 前言 | 第16-17页 |
| 1 直接导入表达富含必需氨基酸的天然优质蛋白质基因 | 第17-21页 |
| ·在种子中表达 | 第17-20页 |
| ·在叶片组织中表达 | 第20-21页 |
| 2 通过蛋白工程进行蛋白质分子设计提高蛋白质中的必需氨基酸含量 | 第21-24页 |
| ·蛋白质序列的修饰 | 第21-23页 |
| ·人工合成优质蛋白质基因 | 第23页 |
| ·同源蛋白质基因表达的修改 | 第23-24页 |
| 3 通过代谢工程增加游离的必需氨基酸 | 第24-27页 |
| 4 结合代谢工程与导入富含必需氨基酸优质蛋白基因实现增加必需氨基酸的来源和沉积 | 第27-28页 |
| 5 通过调控内源基因表达以实现增加或降低某些蛋白组分的方式改变作物营养品质 | 第28-29页 |
| 6 小结与展望 | 第29-31页 |
| 第二部分：研究论文 水稻Gt1 启动子引导大豆Gy7 基因表达载体构建及转化水稻研究 | 第31-95页 |
| 摘要 | 第31-35页 |
| 前言 | 第35-37页 |
| 一、水稻5.3kbGt1 启动子克隆以及Gt1 启动子引导优质大豆球蛋白Gy7 全基因表达载体构建 | 第37-55页 |
| 材料与方法 | 第37-51页 |
| 1 材料和试剂 | 第37-39页 |
| ·植物材料 | 第37页 |
| ·菌株与质粒 | 第37-38页 |
| ·试剂 | 第38-39页 |
| ·培养基 | 第39页 |
| 2 水稻5.3kb谷蛋白GluA-2（Gt1）基因启动子的克隆 | 第39-45页 |
| ·水稻总DNA的提取（CTAB法提取水稻总DNA） | 第39-40页 |
| ·方法 | 第39-40页 |
| ·相关试剂的配制 | 第40页 |
| ·水稻5.3kb谷蛋白Gt1 基因启动子的克隆 | 第40-41页 |
| ·琼脂糖凝胶电泳 | 第41页 |
| ·凝胶的制备 | 第41页 |
| ·加样及进行电泳 | 第41页 |
| ·PCR产物的纯化与目的片段的回收 | 第41-42页 |
| ·PCR产物与pMD 18-T Simple Vector的连接 | 第42页 |
| ·PCR产物与pMD 18-T Simple Vector连接后的转化 | 第42-43页 |
| ·试剂 | 第42页 |
| ·大肠杆菌感受态的制备 | 第42-43页 |
| ·质粒的转化 | 第43页 |
| ·中间载体T-5.3kbGt1 阳性克隆的鉴定 | 第43-44页 |
| ·T-5.3kbGt1 质粒PCR鉴定 | 第43-44页 |
| ·T-5.3kbGt1 质粒酶切鉴定 | 第44页 |
| ·5.3kbGt1 启动子测序 | 第44-45页 |
| 3 表达载体的构建、检测及转化 | 第45-51页 |
| ·中间载体pCAMBIA1300-5.3kbGt1 的构建 | 第45-47页 |
| ·质粒DNA的制备 | 第45页 |
| ·养菌 | 第45页 |
| ·质粒的提取 | 第45页 |
| ·质粒的酶切 | 第45页 |
| ·pCAMBIA1300 质粒的酶切 | 第45页 |
| ·T-5.3kbGt1 质粒的酶切 | 第45页 |
| ·DNA片段的回收 | 第45-46页 |
| ·DNA片段的连接 | 第46页 |
| ·pCAMBIA1300 回收片段和T-5.3kbGt1 质粒回收片段连接后的转化 | 第46页 |
| ·重组质粒（pCAMBIA1300-5.3kbGt1）的鉴定 | 第46-47页 |
| ·酶切鉴定 | 第46-47页 |
| ·PCR鉴定 | 第47页 |
| ·表达载体pCAMBIA1300-5.3kbGt1-Gy7 的构建 | 第47-49页 |
| ·质粒DNA的制备 | 第47页 |
| ·养菌 | 第47页 |
| ·质粒的提取 | 第47页 |
| ·质粒的酶切 | 第47-48页 |
| ·pCAMBIA1300-5.3kbGt1 质粒的酶切 | 第47-48页 |
| ·pCAMBIA1300-1kbGt1-Gy7 质粒的酶切 | 第48页 |
| ·DNA片段的回收 | 第48页 |
| ·DNA片段的连接 | 第48页 |
| ·pCAMBIA1300-5.3kbGt1 回收片段和pCAMBIA1300-1kbGt1-Gy7 质粒回收片段连接后的转化 | 第48页 |
| ·重组质粒（pCAMBIA1300-5.3kbGt1-Gy7）的鉴定 | 第48-49页 |
| ·酶切鉴定 | 第48-49页 |
| ·PCR鉴定 | 第49页 |
| ·pCAMBIA1300-5.3kbGt1-Gy7 质粒转入根癌农杆菌及鉴定 | 第49-51页 |
| ·根癌农杆菌感受态的制备和转化 | 第49-50页 |
| ·根癌农杆菌转化子的鉴定 | 第50-51页 |
| 结果与分析 | 第51-55页 |
| 1. 中间载体T-5.3kbGt1 的鉴定 | 第51-52页 |
| 2. 中间载体pCAMBIA1300-5.3kbGt1 的鉴定 | 第52-53页 |
| 3. 表达载体pCAMBIA1300-5.3kbGt1-Gy7 的鉴定 | 第53-55页 |
| 二、利用共转化法将优质大豆球蛋白Gy7 全基因导入水稻 | 第55-76页 |
| 材料和方法 | 第55-67页 |
| 1. 试验材料 | 第55-56页 |
| ·供试水稻品种 | 第55页 |
| ·菌株、质粒 | 第55页 |
| ·试剂 | 第55-56页 |
| 2. 培养基 | 第56-57页 |
| 3. 试验方法 | 第57-67页 |
| ·水稻幼胚愈伤组织的诱导及培养（吕英海） | 第57页 |
| ·根癌农杆菌的培养及其介导的水稻转化 | 第57-58页 |
| ·根癌农杆菌的培养 | 第57-58页 |
| ·水稻愈伤与根癌农杆菌共培养 | 第58页 |
| ·抗性愈伤组织的筛选及植株再生 | 第58页 |
| ·T_0 代转基因水稻植株总DNA的PCR分析 | 第58-60页 |
| ·CTAB法大量抽提水稻植株叶片的总DNA | 第58页 |
| ·转基因植株中gus基因的PCR分析 | 第58-59页 |
| ·引物设计 | 第58-59页 |
| ·反应体系 | 第59页 |
| ·反应程序 | 第59页 |
| ·共转化植株的筛选 | 第59-60页 |
| ·T_0 代转基因植株的Southern blot分析（ECL） | 第60-62页 |
| ·试剂的制备 | 第60页 |
| ·试验步骤 | 第60-62页 |
| ·酶切 | 第60页 |
| ·电泳 | 第60页 |
| ·电泳和转膜 | 第60-61页 |
| ·探针的制备 | 第61-62页 |
| ·探针的标记和杂交 | 第62页 |
| ·转基因水稻T_1 代幼嫩种子的RT-PCR分析 | 第62-66页 |
| ·水稻种子总RNA的提取与检测 | 第62-64页 |
| ·准备工作 | 第62-63页 |
| ·用TRIZOL Reagent抽提RNA | 第63页 |
| ·电泳检测RNA的质量 | 第63-64页 |
| ·RNase-free的DNaseⅠ（Fermentas MBI）处理总RNA中残留的基因组DNA | 第64页 |
| ·RT-PCR检测 | 第64-66页 |
| ·反转录获得cDNA的第一链 | 第64-65页 |
| ·RT-PCR检测Gy7 基因 | 第65页 |
| ·RT-PCR检测Gt1 基因 | 第65-66页 |
| ·转基因水稻后代种子GUS活性组织化学分析 | 第66页 |
| ·试剂的制备 | 第66页 |
| ·磷酸钠缓冲液 | 第66页 |
| ·GUS染色液的配制 | 第66页 |
| ·试验方法 | 第66页 |
| ·GUS显色结果采用适合度分析 | 第66页 |
| ·无抗性标记基因的转基因植株的筛选 | 第66-67页 |
| 结果与分析 | 第67-76页 |
| 1. 转基因水稻的获得 | 第67页 |
| 2. T_0 代转基因植株PCR检测 | 第67-68页 |
| 3. T_0 代转基因植株的Southern blot检测 | 第68页 |
| 4. RT-PCR检测转基因水稻T1 代未成熟种子Gy7 目的基因的表达 | 第68-72页 |
| ·总RNA的检测 | 第68页 |
| ·RT-PCR检测 | 第68-72页 |
| 5. T_1 代种子GUS检测结果 | 第72-74页 |
| 6. 仅含有目的基因的转基因植株的筛选 | 第74-76页 |
| 三、大豆11S球蛋白Gy7 基因cDNA序列的克隆及含有Gy7 cDNA的安全性表达载体构建 | 第76-90页 |
| 材料与方法 | 第76-84页 |
| 1 材料和试剂 | 第76-77页 |
| ·植物材料 | 第76页 |
| ·菌株与质粒 | 第76页 |
| ·试剂 | 第76-77页 |
| ·培养基 | 第77页 |
| 2 大豆球蛋白Gy7 基因cDNA的获得 | 第77-79页 |
| ·水稻种子总RNA的提取与检测 | 第77页 |
| ·RNase-free的DNaseⅠ（Fermentas MBI）处理总RNA中残留的基因组DNA | 第77页 |
| ·RT-PCR | 第77-78页 |
| ·反转录获得cDNA的第一链 | 第77页 |
| ·RT-PCR扩增获得Gy7 cDNA | 第77-78页 |
| ·琼脂糖凝胶电泳 | 第78页 |
| ·PCR产物的纯化与目的片段的回收 | 第78页 |
| ·PCR产物与pMD 18-T Simple Vector的连接、转化和筛选 | 第78页 |
| ·PCR产物与pMD 18-T Simple Vector的连接 | 第78页 |
| ·PCR产物与pMD 18-T Simple Vector连接（T-1）后的转化 | 第78页 |
| ·T-1 阳性克隆的鉴定 | 第78-79页 |
| ·T-1 质粒PCR鉴定 | 第79页 |
| ·T-1 质粒酶切鉴定 | 第79页 |
| ·T-1 质粒用EcoRⅠ酶切 | 第79页 |
| ·Gy7 基因cDNA序列分析 | 第79页 |
| 3 pCAMBIA1300-5.3kbGt1-Gy7 cDNA表达载体构建 | 第79-84页 |
| ·中间载体T-Gy7 cDNA的构建 | 第79-82页 |
| ·质粒DNA的制备 | 第79页 |
| ·养菌 | 第79页 |
| ·质粒的提取 | 第79页 |
| ·质粒的PCR扩增 | 第79-80页 |
| ·琼脂糖凝胶电泳 | 第80页 |
| ·PCR产物的纯化与目的片段的回收 | 第80页 |
| ·PCR产物与pMD 18-T Simple Vector的连接、转化和筛选 | 第80-81页 |
| ·PCR产物与pMD 18-T Simple Vector的连接 | 第80-81页 |
| ·PCR产物与pMD 18-T Simple Vector连接后（中间载体T-Gy7 cDNA）的转化 | 第81页 |
| ·T-Gy7 cDNA阳性克隆的鉴定 | 第81-82页 |
| ·T-Gy7 cDNA质粒PCR鉴定 | 第81页 |
| ·T-Gy7 cDNA质粒酶切鉴定 | 第81-82页 |
| ·表达载体pCAMBIA1300-5.3kbGt1-Gy7 cDNA的构建 | 第82-83页 |
| ·质粒DNA的制备 | 第82页 |
| ·养菌 | 第82页 |
| ·质粒的提取 | 第82页 |
| ·质粒的酶切 | 第82-83页 |
| ·pCAMBIA1300-5.3kbGt1 质粒用XbaⅠ、XhoⅠ双酶切 | 第82页 |
| ·T-Gy7 cDNA质粒的XbaⅠ、XhoⅠ双酶切 | 第82-83页 |
| ·DNA片段的回收 | 第83页 |
| ·DNA片段的连接 | 第83页 |
| ·pCAMBIA1300-5.3kbGt1回收片段和T-Gy7 cDNA质粒回收片段连接后转化大肠杆菌 | 第83页 |
| ·重组质粒（pCAMBIA1300-5.3kbGt1-Gy7 cDNA）的鉴定 | 第83页 |
| ·pCAMBIA1300-5.3kbGt1-Gy7 cDNA质粒转入农杆菌及鉴定 | 第83-84页 |
| 结果与分析 | 第84-90页 |
| 1. T-1 载体的鉴定 | 第84页 |
| 2. Gy7 基因测序结果与Genbank对应序列比对 | 第84-87页 |
| 3. 中间载体T-Gy7 cDNA的鉴定 | 第87-88页 |
| 4. pCAMBIA1300-5.3kbGt1-Gy7 cDNA表达载体的鉴定 | 第88-90页 |
| 讨论 | 第90-95页 |
| 1. 利用转基因技术改良水稻品质启动子的选用 | 第90-91页 |
| 2. 农杆菌介导转化水稻外源基因拷贝数分析 | 第91页 |
| 3. 采用基因工程技术改良水稻营养品质 | 第91-92页 |
| 4. 基因全序列和cDNA序列转基因研究对外源基因表达的影响 | 第92-94页 |
| 5. 转基因水稻的安全性及本试验工作的展望 | 第94-95页 |
| 参考文献 | 第95-105页 |
| 附录：水稻转化相关培养基 | 第105-106页 |
| 中英文对照 | 第106-109页 |
| 研究生期间论文及研究成果 | 第109页 |
