| 中文摘要 | 第1-7页 |
| 英文摘要 | 第7-9页 |
| 前言 | 第9-17页 |
| 1.安全和有效是当今基因治疗中共同关注的两大主题 | 第9页 |
| 2.病毒载体系统具有较高的基因转移效率但有严重的安全性问题 | 第9-10页 |
| 3.非病毒载体安全性好但效率较低 | 第10-11页 |
| 4.靶细胞是影响基因治疗效率的重要因素 | 第11-14页 |
| 5.本研究拟通过扩增基因修饰的B淋巴细胞提高基因治疗的效率 | 第14-17页 |
| 材料与方法 | 第17-46页 |
| 一、材料 | 第17-19页 |
| 1 菌株 | 第17页 |
| 2 细胞系 | 第17页 |
| 3 限制性内切酶及其它酶类 | 第17页 |
| 4 载体 | 第17页 |
| 5 特异性抗体序列及抗原 | 第17-18页 |
| 6 实验动物 | 第18页 |
| 7 主要试剂及试剂盒 | 第18页 |
| 8 主要仪器 | 第18-19页 |
| 二、实验方法 | 第19-46页 |
| 1.质粒载体的构建方法 | 第19-23页 |
| ·酶切反应 | 第19页 |
| ·DNA片段回收 | 第19-20页 |
| ·连接反应 | 第20页 |
| ·感受态大肠杆菌细胞制备 | 第20页 |
| ·转化 | 第20-21页 |
| ·质粒DNA的小量制备 | 第21页 |
| ·质粒DNA的大量制备 | 第21-22页 |
| ·RT-PCR | 第22页 |
| ·PCR扩增DNA片段 | 第22-23页 |
| 2 实验用载体的构建 | 第23-38页 |
| ·逆转录病毒载体pMEGFP的构建 | 第23-24页 |
| ·逆转录病毒载体pMELHCP1的构建(表达EGFP以及汉滩型汉坦病毒核心蛋白特异性mIgG1) | 第24-32页 |
| ·逆转录病毒载体pME5C3LH1的构建(表达EGFP以及乙肝病毒表面抗原特异性的mIgG1) | 第32-37页 |
| ·逆转录病毒载体pMhE5C31的构建(表达hEPO以及乙型肝炎病毒表面抗原特异性mIgG1) | 第37-38页 |
| 3 细胞培养 | 第38-41页 |
| ·细胞生长条件 | 第38-39页 |
| ·脾细胞分离 | 第39-41页 |
| ·细胞传代 | 第41页 |
| ·复苏及冻存 | 第41页 |
| 4 细胞转染及病毒载体包装 | 第41-42页 |
| 5 免疫荧光 | 第42-43页 |
| 6 与包装细胞系PT67共培养法感染原代小鼠脾B淋巴细胞 | 第43页 |
| 7 荧光显微镜下观察感染后的表达绿色荧光蛋白的小鼠脾细胞 | 第43页 |
| 8 载体pMELHCP1感染的小鼠原代脾B淋巴细胞的体外扩增实验 | 第43-44页 |
| 9 细胞移植与受体鼠抗原免疫 | 第44页 |
| 10 FACS定量分析表达绿色荧光蛋白细胞的比例 | 第44页 |
| 11 BALB/c小鼠取血检测hEPO的表达水平 | 第44-46页 |
| 结果 | 第46-57页 |
| 1.载体构建 | 第46-49页 |
| ·逆转录病毒载体pMEGFP的构建 | 第46页 |
| ·逆转录病毒载体pMELHCP1的构建 | 第46-47页 |
| ·逆转录病毒载体pME5C3LH1的构建 | 第47-48页 |
| ·逆转录病毒载体pMhE5C31的构建 | 第48-49页 |
| 2.pMELHCP1载体表达的汉滩型汉坦病毒核心蛋白特异性mIgG1能够与抗原汉滩型汉坦病毒核心蛋白特异性结合 | 第49-50页 |
| 3.pMELHCP1载体基因修饰的B淋巴细胞能够被抗原汉滩型汉坦病毒核心蛋白在体外特异性扩增 | 第50-53页 |
| 4.pMELHCP1载体基因修饰的脾B淋巴细胞在SCID受体鼠体内能够被抗原汉滩型汉坦病毒核心蛋白特异性扩增 | 第53-55页 |
| 5.外源治疗基因hEPO表达水平在BALB/c小鼠体内抗原特异性刺激后增高 | 第55-57页 |
| 讨论 | 第57-66页 |
| 1.通过体内抗原特异性扩增基因修饰的B淋巴细胞可以提高外源治疗基因的表达水平 | 第57-58页 |
| 2.BCR和其特异性抗原之间的亲和力有可能会影响基因修饰的B淋巴细胞在体内扩增的效率和寿命 | 第58-62页 |
| 3.与mIgM和mIgD型BCR相比mIgG1型BCR可能更有效地增加外源治疗基因的表达 | 第62-63页 |
| 4.本研究需要安全的基因治疗载体的配合 | 第63-66页 |
| 小结 | 第66-67页 |
| 参考文献 | 第67-71页 |
| 非论文综述 | 第71-79页 |
| 缩略语 | 第79-81页 |
| 致谢 | 第81-82页 |
| 个人简历 | 第82-85页 |
