| 摘要 | 第1-16页 |
| Abstract | 第16-21页 |
| 前言 | 第21-23页 |
| 第一部分 文献综述 | 第23-51页 |
| 第一章 弓形虫与弓形虫病 | 第24-32页 |
| 1. 病原及其形态特征 | 第24-27页 |
| ·滋养体 | 第24-25页 |
| ·包囊 | 第25-26页 |
| ·裂殖体 | 第26页 |
| ·配子体 | 第26页 |
| ·卵囊 | 第26-27页 |
| 2 生活史 | 第27-29页 |
| ·弓形虫在中间宿主体内的发育 | 第27-28页 |
| ·弓形虫在终末宿主体内发育 | 第28-29页 |
| 3 弓形虫虫株 | 第29页 |
| 4 流行病学 | 第29-30页 |
| 5 临床症状及病理变化 | 第30页 |
| 6 弓形虫病的治疗 | 第30-31页 |
| 7 小结与展望 | 第31-32页 |
| 第二章 弓形虫入侵宿主细胞及其相关功能蛋白研究进展 | 第32-38页 |
| 1 弓形虫入侵过程 | 第32-33页 |
| 2 弓形虫入侵相关蛋白 | 第33-35页 |
| ·致密颗粒 | 第33页 |
| ·棒状体蛋白 | 第33-34页 |
| ·微线体蛋白 | 第34-35页 |
| 3 分泌性蛋白的合成及转运 | 第35页 |
| 4 分泌性蛋白的分泌机制 | 第35-36页 |
| 5 小结与展望 | 第36-38页 |
| 第三章 微线体蛋白功能的研究进展 | 第38-44页 |
| 1 微线体蛋白的信号分选 | 第38-40页 |
| ·微线体蛋白进入内质网及从高尔基体外侧网络输出 | 第38页 |
| ·特殊的可溶性分泌蛋白的定位 | 第38-39页 |
| ·蛋白折叠 | 第39页 |
| ·蛋白水解 | 第39-40页 |
| ·蛋白表达时间 | 第40页 |
| 2 信号转导—在正确的时间激发蛋白分泌 | 第40-41页 |
| 3 微线体蛋白的粘附作用 | 第41-42页 |
| ·微线体蛋白MIC1和MIC2-凝血栓蛋白类似的结构域 | 第41页 |
| ·微线体蛋白MIC3:表皮生长因子结构区域 | 第41-42页 |
| ·微线体蛋白MIC4:苹果结构区域 | 第42页 |
| 4 形成正确的连接:与肌动球蛋白相关联 | 第42-43页 |
| ·微线体蛋白后端"戴帽" | 第42-43页 |
| ·肌动蛋白及肌浆球蛋白的拓扑结构 | 第43页 |
| 5 小结 | 第43-44页 |
| 第四章 弓形虫保护性抗原及疫苗研究进展 | 第44-51页 |
| 1 产生保护性免疫的机制 | 第44页 |
| 2 商品化的弓形虫疫苗 | 第44-45页 |
| 3 疫苗候选抗原 | 第45-49页 |
| ·膜表面抗原 | 第45-46页 |
| ·棒状体蛋白抗原 | 第46-47页 |
| ·微线体蛋白抗原 | 第47-48页 |
| ·致密颗粒抗原 | 第48页 |
| ·缓殖子时期特异性抗原 | 第48-49页 |
| 4 弓形虫疫苗存在的关键问题 | 第49页 |
| 5 小结与展望 | 第49-51页 |
| 第二部分 研究内容 | 第51-151页 |
| 第五章 弓形虫MIC3基因DNA克隆及生物信息学分析 | 第52-70页 |
| 1 材料与方法 | 第53-56页 |
| ·弓形虫虫株及基因组DNA | 第53页 |
| ·菌株和质粒 | 第53页 |
| ·工具酶与试剂 | 第53页 |
| ·主要仪器 | 第53页 |
| ·弓形虫基因组DNA的制备 | 第53-54页 |
| ·弓形虫MIC3基因及其5’端与3’端的DNA扩增 | 第54页 |
| ·PCR产物的克隆 | 第54页 |
| ·DNA序列测定 | 第54页 |
| ·克隆序列的生物信息学分析 | 第54-56页 |
| ·系统进化树分析 | 第55页 |
| ·MIC35’flanking序列主要启动子基序分析 | 第55页 |
| ·MIC3蛋白物理化学性质分析 | 第55页 |
| ·MIC3蛋白亲水性和疏水性的预测 | 第55页 |
| ·MIC3蛋白保守结构域和功能域的预测 | 第55页 |
| ·MIC3蛋白蛋白质信号肽、二级结构及抗原性分析 | 第55-56页 |
| ·MIC3蛋白高级结构预测 | 第56页 |
| 2 结果 | 第56-67页 |
| ·PCR扩增结果 | 第56-57页 |
| ·弓形虫MIC3基因的克隆、PCR鉴定及酶切分析 | 第57页 |
| ·序列比对 | 第57-62页 |
| ·克隆序列的生物信息学分析 | 第62-67页 |
| ·系统进化分析 | 第62-63页 |
| ·MIC35’flanking序列主要启动子基序分析 | 第63-64页 |
| ·MIC3蛋白物理化学性质分析 | 第64-65页 |
| ·MIC3蛋白亲水性和疏水性的预测 | 第65页 |
| ·MIC3蛋白保守结构域和功能域的预测 | 第65-66页 |
| ·MIC3蛋白蛋白质信号肽、二级结构及抗原性分析 | 第66页 |
| ·MIC3蛋白高级结构预测 | 第66-67页 |
| 3 讨论 | 第67-70页 |
| 第六章 微线体蛋白MIC3基因5’上游序列转录活性分析及MIC3细胞定位研究 | 第70-88页 |
| 1 材料与方法 | 第71-77页 |
| ·材料 | 第71-72页 |
| ·弓形虫虫株 | 第71页 |
| ·细菌和质粒 | 第71页 |
| ·分子生物学试剂 | 第71页 |
| ·细胞学试剂及配制 | 第71-72页 |
| ·主要仪器 | 第72页 |
| ·溶液配制 | 第72页 |
| ·方法 | 第72-77页 |
| ·弓形虫荧光表达虫株的构建 | 第72-74页 |
| ·携带有EGFP基因的重组表达载体在弓形虫体内的转基因表达 | 第74-75页 |
| ·微线体蛋白MIC3的细胞定位 | 第75-76页 |
| ·弓形虫基因工程株的RT-PCR鉴定 | 第76-77页 |
| 2 结果 | 第77-85页 |
| ·弓形虫微线体MIC3基因5’flanking克隆的PCR鉴定及酶切分析 | 第77-78页 |
| ·EGFP-SAG1 3’UTR克隆的PCR鉴定及酶切分析 | 第78-79页 |
| ·含有SAG1启动子的Ble基因克隆的PCR鉴定及酶切分析 | 第79-80页 |
| ·荧光表达载体pBSK-5’flanking-egfp-SAGl 3’UTR-SAGl pro-ble的PCR鉴定及酶切分析 | 第80-81页 |
| ·荧光表达载体pBSK-5’flanking-egfp-SAG1 3’UTR-SAG1 pro-ble的测序分析 | 第81页 |
| ·荧光表达载体pBSK-5’flanking-MIC3 egfp-SAGl 3'UTR-SAGl pro-ble的PCR鉴定及酶切分析 | 第81-82页 |
| ·荧光表达载体pBSK-5’flanking-MIC3 egfp-SAGl 3’UTR-SAGl pro-ble的测序分析 | 第82页 |
| ·微线体蛋白MIC3 5’flanking启动的EGFP基因在弓形虫体内的表达 | 第82-83页 |
| ·微线体蛋白MIC3 5’flanking启动的MIC3-EGFP基因在弓形虫体内的表达 | 第83-84页 |
| ·弓形虫基因工程株EGFP、MIC3基因的RT-PCR扩增 | 第84-85页 |
| 3 讨论 | 第85-88页 |
| 第七章 弓形虫微线体蛋白MIC3过量表达对虫体的影响 | 第88-106页 |
| 1 材料与方法 | 第89-95页 |
| ·材料 | 第89-90页 |
| ·弓形虫虫株 | 第89页 |
| ·细菌和质粒 | 第89页 |
| ·分子生物学试剂 | 第89页 |
| ·细胞学试剂及配制 | 第89页 |
| ·主要仪器 | 第89-90页 |
| ·溶液配制 | 第90页 |
| ·方法 | 第90-95页 |
| ·弓形虫微线体蛋白MIC3过量表达虫株的构建 | 第90-92页 |
| ·携带有MIC3基因的重组表达载体在弓形虫体内的转基因表达 | 第92-93页 |
| ·弓形虫过表达虫株的RT-PCR鉴定 | 第93-94页 |
| ·弓形虫MIC3过表达虫株的荧光定量RT-PCR鉴定 | 第94-95页 |
| ·弓形虫MIC3过表达对虫体入侵宿主细胞及胞内增殖的影响 | 第95页 |
| ·弓形虫MIC3过表达对虫体生长繁殖的影响 | 第95页 |
| 2 结果 | 第95-103页 |
| ·弓形虫微线体MIC3基因5’flanking克隆的PCR鉴定及酶切分析 | 第95-96页 |
| ·MIC3-SAG1 3’UTR克隆的PCR鉴定及酶切分析 | 第96-97页 |
| ·含有SAG1启动子的Ble基因克隆的PCR鉴定及酶切分析 | 第97-98页 |
| ·MIC3过表达载体pBSK-5’flanking MIC3-SAG1 3’UTR-SAGl pro-ble的PCR鉴定及酶切分析 | 第98-99页 |
| ·MIC3过表达载体pBSK-5’flanking-MIC3-SAG1 3’UTR-SAG1 pro-ble的测序分析 | 第99页 |
| ·微线体蛋白MIC3 5’flanking启动的MIC3基因在弓形虫体内的表达 | 第99-100页 |
| ·MIC3过表达虫株的荧光定量PCR鉴定 | 第100-101页 |
| ·弓形虫MIC3过表达株入侵及增殖差异 | 第101-103页 |
| ·弓形虫MIC3对虫体生长繁殖的影响 | 第103页 |
| 3 讨论 | 第103-106页 |
| 第八章 弓形虫重组蛋白MIC3的免疫原性研究 | 第106-123页 |
| 1 材料和方法 | 第107-113页 |
| ·材料 | 第107-108页 |
| ·弓形虫虫株 | 第107页 |
| ·细菌和质粒 | 第107页 |
| ·分子生物学试剂 | 第107页 |
| ·免疫学试剂 | 第107页 |
| ·细胞学试剂及配制 | 第107-108页 |
| ·主要仪器 | 第108页 |
| ·弓形虫微线体蛋白MIC3的表达与纯化 | 第108-110页 |
| ·弓形虫MIC3基因的扩增 | 第108-109页 |
| ·原核表达载体的构建 | 第109页 |
| ·序列测定与分析 | 第109页 |
| ·IPTG诱导大肠杆菌表达目的蛋白 | 第109页 |
| ·SDS-PAGE | 第109-110页 |
| ·Western-blotting | 第110页 |
| ·目的蛋白的纯化与复性 | 第110页 |
| ·实验分组及免疫 | 第110-111页 |
| ·试验动物及分组 | 第110页 |
| ·免疫 | 第110-111页 |
| ·各项免疫指标的测定 | 第111-113页 |
| ·间接ELISA法检测抗体水平 | 第111页 |
| ·抗体亚类的检测 | 第111页 |
| ·MTT法检测淋巴细胞增殖 | 第111-112页 |
| ·双抗夹心ELISA法检测细胞因子浓度 | 第112-113页 |
| ·攻击感染 | 第113页 |
| ·数据分析 | 第113页 |
| 2 结果 | 第113-120页 |
| ·PCR扩增结果 | 第113页 |
| ·重组质粒pET30a-MIC3的PCR及酶切鉴定 | 第113-114页 |
| ·重组质粒pET30a-MIC3的测序 | 第114-115页 |
| ·pET30a-MIC3的原核表达及Western-blot | 第115-116页 |
| ·融合蛋白MIC3诱导体液免疫应答 | 第116-117页 |
| ·MIC3抗体亚类的检测 | 第117-118页 |
| ·淋巴细胞转化试验 | 第118-119页 |
| ·免疫后小鼠脾细胞上清液中细胞因子的检测 | 第119页 |
| ·免疫鼠抗攻击感染的保护性观察 | 第119-120页 |
| 3 讨论 | 第120-123页 |
| 第九章 减毒沙门氏菌为载体传递弓形虫MIC3/P30基因的免疫原性研究 | 第123-151页 |
| 1 材料和方法 | 第124-133页 |
| ·材料 | 第124-126页 |
| ·细菌、载体、质粒和细胞株 | 第124-125页 |
| ·试验动物 | 第125页 |
| ·分子生物学试剂 | 第125页 |
| ·免疫学试剂 | 第125页 |
| ·细胞学试剂及配制 | 第125页 |
| ·主要仪器 | 第125-126页 |
| ·方法 | 第126-133页 |
| ·真核表达载体的构建 | 第126-128页 |
| ·以沙门氏菌为载体传递弓形虫基因疫苗的构建 | 第128-129页 |
| ·减毒沙门氏菌传递弓形虫基因疫苗的安全性与稳定性实验 | 第129-130页 |
| ·减毒沙门氏菌传递弓形虫基因疫苗的免疫效果研究 | 第130-133页 |
| ·数据分析 | 第133页 |
| 2 结果 | 第133-148页 |
| ·真核表达载体pcDNA3.1-P30/MIC3的构建 | 第133-135页 |
| ·Top10中重组质粒的鉴定 | 第135-139页 |
| ·重组质粒的PCR鉴定和酶切鉴定 | 第135-136页 |
| ·重组质粒的测序 | 第136-138页 |
| ·沙门氏菌中重组质粒的鉴定 | 第138-139页 |
| ·对小鼠的安全性 | 第139-141页 |
| ·DNA疫苗免疫对小鼠体重的影响 | 第139页 |
| ·重组菌株口服免疫后在不同组织中消长动态 | 第139-141页 |
| ·重组菌在体外的稳定性 | 第141-143页 |
| ·重组沙门氏菌在氨苄平板中的稳定性 | 第141-142页 |
| ·重组沙门氏菌在液体LB中的稳定性 | 第142-143页 |
| ·重组菌在体内的稳定性 | 第143-144页 |
| ·DNA疫苗诱导体液免疫应答 | 第144-145页 |
| ·抗体亚类的检测 | 第145-146页 |
| ·疫苗免疫对淋巴细胞转化水平的影响 | 第146页 |
| ·免疫后小鼠脾细胞上清液中细胞因子的检测 | 第146-147页 |
| ·免疫小鼠抗攻击感染的保护性观察 | 第147-148页 |
| 3 讨论 | 第148-151页 |
| 全文结论 | 第151-152页 |
| 论文创新性 | 第152-153页 |
| 研究展望 | 第153-154页 |
| 附录 | 第154-159页 |
| 致谢 | 第159-160页 |
| 攻读博士学位期间的主要成果 | 第160-161页 |
| 参考文献 | 第161-172页 |
