| 摘要 | 第10-11页 |
| 英文摘要 | 第11-12页 |
| 1 前言 | 第13-20页 |
| 1.1 研究目的与意义 | 第13页 |
| 1.2 紫花苜蓿概况 | 第13-14页 |
| 1.3 紫花苜蓿的抗逆性研究 | 第14-16页 |
| 1.3.1 紫花苜蓿的抗盐碱性 | 第14页 |
| 1.3.2 紫花苜蓿的抗旱性 | 第14-15页 |
| 1.3.3 紫花苜蓿的抗低温性 | 第15-16页 |
| 1.4 RCI2类基因的研究进展 | 第16-18页 |
| 1.4.1 RCI2类基因响应多种非生物胁迫且受激素调节 | 第16-17页 |
| 1.4.2 参与低温胁迫 | 第17页 |
| 1.4.3 参与盐碱胁迫和渗透胁迫 | 第17-18页 |
| 1.4.4 参与干旱胁迫、高温胁迫 | 第18页 |
| 1.5 本研究的主要内容 | 第18-20页 |
| 1.5.1 研究内容 | 第18-19页 |
| 1.5.2 技术路线 | 第19-20页 |
| 2 材料与方法 | 第20-32页 |
| 2.1 实验材料 | 第20-21页 |
| 2.1.1 植物材料 | 第20页 |
| 2.1.2 所用数据库与生物分析软件及网址 | 第20页 |
| 2.1.3 载体及菌株 | 第20页 |
| 2.1.4 常用酶类及试剂 | 第20-21页 |
| 2.1.5 培养基 | 第21页 |
| 2.2 苜蓿中RCI2类基因家族成员查找 | 第21-22页 |
| 2.3 MSRCI2A、MSRCI2B、MSRCI2C基因在非生物胁迫下的表达 | 第22-24页 |
| 2.3.1 非生物胁迫处理紫花苜蓿 | 第22页 |
| 2.3.2 提取紫花苜蓿总RNA | 第22页 |
| 2.3.3 cDNA的合成 | 第22-23页 |
| 2.3.4 实时荧光定量qPCR | 第23-24页 |
| 2.4 MSRCI2A、MSRCI2B、MSRCI2C基因的克隆及序列分析 | 第24-26页 |
| 2.4.1 MsRCI2A、MsRCI2B、MsRCI2C的基因克隆 | 第24-26页 |
| 2.4.2 RCI2类基因家族的分析 | 第26页 |
| 2.5 MSRCI2A、MSRCI2B、MSRCI2C基因表达载体的构建 | 第26-28页 |
| 2.5.1 载体骨架Cas9 MDC123双酶切 | 第26-27页 |
| 2.5.2 目的基因与线性载体胶回收纯化 | 第27页 |
| 2.5.3 目的基因与线性载体连接 | 第27页 |
| 2.5.4 大肠杆菌的转化 | 第27页 |
| 2.5.5 质粒提取 | 第27页 |
| 2.5.6 PCR验证 | 第27-28页 |
| 2.5.7 农杆菌转化 | 第28页 |
| 2.6 转基因苜蓿的遗传转化过程 | 第28-29页 |
| 2.6.1 草铵膦筛选压力的确定 | 第28页 |
| 2.6.2 转基因植株的再生过程 | 第28-29页 |
| 2.7 抗性植株的检测及扦插扩繁 | 第29-30页 |
| 2.7.1 植物基因组DNA提取及PCR检测 | 第29-30页 |
| 2.7.2 植物基因组RNA提取及RT-PCR检测 | 第30页 |
| 2.7.3 qRT-PCR检测 | 第30页 |
| 2.7.4 转基因株系与对照株系的扦插扩繁 | 第30页 |
| 2.8 碱胁迫下转基因苜蓿和非转基因苜蓿的生理与生化指标测定 | 第30-31页 |
| 2.8.1 碱胁迫处理及待测样品的取材 | 第30-31页 |
| 2.8.2 叶绿素含量的测定 | 第31页 |
| 2.8.3 电导率的测定 | 第31页 |
| 2.9 数据整理与分析 | 第31-32页 |
| 3 结果与分析 | 第32-65页 |
| 3.1 苜蓿中RCI2类基因家族成员的查找及目的基因的确定 | 第32页 |
| 3.2 MSRCI2A、MSRCI2B、MSRCI2C基因在非生物胁迫下的表达 | 第32-35页 |
| 3.2.1 RCI2类基因在ABA诱导下的表达分析 | 第32-33页 |
| 3.2.2 RCI2类基因在低温胁迫下的表达分析 | 第33-34页 |
| 3.2.3 RCI2类基因在干旱胁迫下的表达分析 | 第34页 |
| 3.2.4 RCI2类基因在碱胁迫下的表达分析 | 第34-35页 |
| 3.3 MSRCI2A、MSRCI2B、MSRCI2C基因的克隆及序列分析 | 第35-40页 |
| 3.3.1 MsRCI2A、MsRCI2B、MsRCI2C基因的克隆结果 | 第35-37页 |
| 3.3.2 序列分析 | 第37-40页 |
| 3.4 MSRCI2A、MSRCI2B、MSRCI2C基因表达载体的构建 | 第40-42页 |
| 3.5 植物表达载体导入农杆菌 | 第42-43页 |
| 3.6 草铵膦筛选压力的确定 | 第43-44页 |
| 3.7 抗性植株的分子生物学检测 | 第44-48页 |
| 3.7.1 转MsRCI2A基因抗性株系的分子生物学检测 | 第44-45页 |
| 3.7.2 转MsRCI2B基因抗性株系的分子生物学检测 | 第45-47页 |
| 3.7.3 转MsRCI2C基因抗性株系的分子生物学检测 | 第47-48页 |
| 3.8 转基因紫花苜蓿株系的表型分析 | 第48-50页 |
| 3.8.1 超量表达MsRCI2A基因苜蓿的表型分析 | 第48-49页 |
| 3.8.2 超量表达MsRCI2B基因苜蓿的表型分析 | 第49页 |
| 3.8.3 超量表达MsRCI2C基因苜蓿的表型分析 | 第49-50页 |
| 3.9 碱胁迫下转基因紫花苜蓿生理指标及相关基因的分析 | 第50-65页 |
| 3.9.1 碱胁迫下转基因紫花苜蓿叶绿素含量的变化 | 第50-52页 |
| 3.9.2 碱胁迫下转基因紫花苜蓿相对电导率的变化 | 第52-53页 |
| 3.9.3 碱胁迫下转基因紫花苜蓿中脯氨酸含量的变化 | 第53-55页 |
| 3.9.4 碱胁迫下转基因紫花苜蓿中可溶性糖含量的变化 | 第55-56页 |
| 3.9.5 碱胁迫下转基因紫花苜蓿丙二醛含量的变化 | 第56-58页 |
| 3.9.6 碱胁迫下转基因紫花苜蓿中SOD酶活的变化 | 第58-59页 |
| 3.9.7 碱胁迫下转基因紫花苜蓿中POD酶活的变化 | 第59-61页 |
| 3.9.8 碱胁迫下转基因紫花苜蓿中CAT酶活的变化 | 第61-62页 |
| 3.9.9 碱胁迫下转基因苜蓿中的胁迫响应基因的表达变化 | 第62-65页 |
| 4 讨论 | 第65-68页 |
| 4.1 目的基因的选择 | 第65页 |
| 4.2 MSRCI2A、MSRCI2B、MSRCI2C基因对非生物胁迫的应答 | 第65-66页 |
| 4.3 转基因植株的耐碱生理机制和相关基因的表达 | 第66-68页 |
| 5 结论 | 第68-69页 |
| 致谢 | 第69-70页 |
| 参考文献 | 第70-77页 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 | 第77页 |
