| 摘要 | 第5-7页 |
| Abstract | 第7-9页 |
| 第一章 文献综述 | 第16-31页 |
| 1.1 粘质沙雷氏菌简介 | 第16页 |
| 1.2 2,3-丁二醇的性质以及用途 | 第16页 |
| 1.3 2,3-丁二醇的生产方法简述 | 第16-17页 |
| 1.4 生产2,3-丁二醇的微生物 | 第17页 |
| 1.5 2,3-丁二醇的分离纯化研究 | 第17-18页 |
| 1.6 微生物生成2,3-丁二醇的代谢途径 | 第18-19页 |
| 1.7 2,3-丁二醇合成途径中的相关基因及其所受到的调控 | 第19-21页 |
| 1.8 细菌群体感应简介 | 第21-22页 |
| 1.9 群体感应系统对沙雷氏菌的调控 | 第22-23页 |
| 1.10 2,3-丁二醇的旋光异构体及形成机制 | 第23-27页 |
| 1.11 合成2,3-丁二醇的代谢工程研究 | 第27-29页 |
| 1.12 粘质沙雷氏菌中的代谢工程 | 第29-30页 |
| 1.13 论文研究意义和研究内容 | 第30-31页 |
| 1.13.1 论文研究意义 | 第30页 |
| 1.13.2 论文研究内容: | 第30-31页 |
| 第二章 粘质沙雷氏菌合成2,3-丁二醇相关基因的克隆和验证 | 第31-65页 |
| 2.1 引言 | 第31页 |
| 2.2 实验材料和方法 | 第31-49页 |
| 2.2.1 菌株、质粒和引物 | 第31-33页 |
| 2.2.2 实验所用仪器 | 第33页 |
| 2.2.3 实验所用试剂 | 第33-34页 |
| 2.2.4 分子生物学试剂 | 第34-35页 |
| 2.2.5 培养基以及抗生素 | 第35页 |
| 2.2.6 粘质沙雷氏菌MG1基因组DNA的提取 | 第35页 |
| 2.2.7 大肠杆菌质粒DNA的提取 | 第35-36页 |
| 2.2.8 胶回收DNA片段 | 第36页 |
| 2.2.9 溶液回收DNA片段 | 第36-37页 |
| 2.2.10 α-乙酰乳酸合成酶基因,α-乙酰乳酸脱羧酶基因部分序列的克隆 | 第37-38页 |
| 2.2.10.1 PCR反应体系 | 第37页 |
| 2.2.10.2 PCR扩增条件 | 第37-38页 |
| 2.2.11 目的片段和pMD18T载体的连接和转化 | 第38页 |
| 2.2.12 E.coli Top10感受态细胞制备 | 第38页 |
| 2.2.13 感受态细胞的DNA转化 | 第38-39页 |
| 2.2.14 α-乙酰乳酸合成酶基因,α-乙酰乳酸脱羧酶基因中间序列的获得 | 第39页 |
| 2.2.15 α-乙酰乳酸合成酶基因,α-乙酰乳酸脱羧酶基因两侧序列的获得 | 第39-41页 |
| 2.2.16 粘质沙雷氏菌2,3-丁二醇脱氢酶的克隆 | 第41-42页 |
| 2.2.17 2,3-丁二醇代谢途径相关基因在大肠杆菌中的表达 | 第42页 |
| 2.2.17.1 限制性酶切反应 | 第42页 |
| 2.2.18 重组蛋白的诱导表达 | 第42页 |
| 2.2.19 SDS-PAGE电泳分析 | 第42-43页 |
| 2.2.20 2,3-丁二醇合成基因的体内功能验证 | 第43-44页 |
| 2.2.20.1 各PCR反应体系 | 第43-44页 |
| 2.2.20.2 PCR反应条件 | 第44页 |
| 2.2.21 自杀载体构建 | 第44-45页 |
| 2.2.21.1 限制性内切酶酶切体系 | 第44页 |
| 2.2.21.2 连接反应体系 | 第44-45页 |
| 2.2.22 大肠杆菌-粘质沙雷氏菌的结合转移 | 第45页 |
| 2.2.23 基因插入失活突变株的鉴定 | 第45-46页 |
| 2.2.23.1 PCR反应体系 | 第45页 |
| 2.2.23.2 PCR扩增条件 | 第45-46页 |
| 2.2.24 2,3-丁二醇合成相关基因突变株的功能验证 | 第46页 |
| 2.2.24.1 发酵培养基 | 第46页 |
| 2.2.24.2 发酵过程(摇瓶) | 第46页 |
| 2.2.25 粘质沙雷氏菌菌体浓度测定方法 | 第46-47页 |
| 2.2.26 蔗糖浓度测定方法 | 第47页 |
| 2.2.27 产物测定方法 | 第47-49页 |
| 2.2.27.1 发酵液的预处理 | 第47页 |
| 2.2.27.2 气相色谱法测定2,3-丁二醇和乙偶姻的浓度 | 第47-48页 |
| 2.2.27.3 2,3-丁二醇和乙偶姻标准曲线的建立 | 第48-49页 |
| 2.2.28 基因失活对粘质沙雷氏菌产乙偶姻的影响 | 第49页 |
| 2.3 实验结果与讨论 | 第49-63页 |
| 2.3.1 2,3-丁二醇合成相关基因克隆策略 | 第49-54页 |
| 2.3.1.1 粘质沙雷氏菌MG1基因组的提取 | 第50页 |
| 2.3.1.2 α-乙酰乳酸脱羧酶基因和α-乙酰乳酸合成酶基因的部分片段克隆 | 第50-51页 |
| 2.3.1.3 α-乙酰乳酸合成酶基因,α-乙酰乳酸脱羧酶基因中间序列的获得 | 第51页 |
| 2.3.1.4 使用基因组走读扩增两侧序列 | 第51-53页 |
| 2.3.1.5 2,3-丁二醇脱氢酶基因的克隆 | 第53-54页 |
| 2.3.2 2,3-丁二醇合成途径基因的结构以及生物信息学分析 | 第54-55页 |
| 2.3.3 2,3-丁二醇代谢途径相关基因表达 | 第55-57页 |
| 2.3.3.1 重组质粒的双酶切验证及测序 | 第56-57页 |
| 2.3.3.2 2,3-丁二醇合成基因在大肠杆菌中的诱导表达 | 第57页 |
| 2.3.4 2,3-丁二醇合成基因的进化树建立 | 第57-59页 |
| 2.3.5 2,3-丁二醇合成基因的体内功能验证 | 第59-63页 |
| 2.3.5.1 2,3-丁二醇合成途径基因突变菌株的构建 | 第59页 |
| 2.3.5.2 slaA,slaB和slaC基因片段的扩增 | 第59-60页 |
| 2.3.5.3 各基因自杀载体的构建 | 第60页 |
| 2.3.5.4 粘质沙雷氏菌突变株的鉴定 | 第60-61页 |
| 2.3.5.5 突变菌株产2,3-丁二醇能力的测定 | 第61-63页 |
| 2.4 本章小结 | 第63-65页 |
| 第三章 2,3-丁二醇合成的调控机制研究 | 第65-85页 |
| 3.1 引言 | 第65页 |
| 3.2 实验材料 | 第65-71页 |
| 3.2.1 菌株,质粒和引物 | 第65-66页 |
| 3.2.2 实验所用试剂 | 第66页 |
| 3.2.3 培养基和抗生素 | 第66页 |
| 3.2.4 粘质沙雷氏菌MG1基因组DNA提取 | 第66页 |
| 3.2.5 调控因子slaR,swrI和swrR突变株的构建 | 第66-68页 |
| 3.2.5.1 基因片段的扩增体系 | 第67页 |
| 3.2.5.2 各基因片段的扩增条件 | 第67页 |
| 3.2.5.3 限制性内切酶酶切体系 | 第67页 |
| 3.2.5.4 连接反应体系 | 第67页 |
| 3.2.5.5 E.coli S17-1λpir感受态细胞制备 | 第67页 |
| 3.2.5.6 连接产物转化 | 第67-68页 |
| 3.2.5.7 大肠杆菌-粘质沙雷氏菌结合转移 | 第68页 |
| 3.2.5.8 突变菌株的验证 | 第68页 |
| 3.2.6 调控基因缺失对粘质沙雷氏菌生长,乙偶姻和2,3-丁二醇合成的影响 | 第68页 |
| 3.2.6.1 调控基因缺失对粘质沙雷氏菌生长的影响 | 第68页 |
| 3.2.6.2 调控基因缺失对粘质沙雷氏菌产酸的影响 | 第68页 |
| 3.2.6.3 调控基因缺失对粘质沙雷氏菌产乙偶姻和2,3-丁二醇的影响 | 第68页 |
| 3.2.7 SlaR和群体感应效应对于2,3-丁二醇合成基因转录的调控 | 第68-69页 |
| 3.2.8 pH对于2,3-丁二醇合成基因转录水平的影响 | 第69页 |
| 3.2.9 乙酸对2,3-丁二醇合成基因转录水平的影响 | 第69页 |
| 3.2.10 荧光定量PCR研究基因调控 | 第69-71页 |
| 3.2.10.1 样品的RNA抽提(试剂盒法) | 第69-70页 |
| 3.2.10.2 cDNA合成 | 第70页 |
| 3.2.10.3 Realtime PCR反应体系 | 第70-71页 |
| 3.2.10.4 Realtime PCR反应扩增条件 | 第71页 |
| 3.2.10.5 Realtime PCR反应结果计算 | 第71页 |
| 3.2.11 swrR基因失活对粘质沙雷氏菌MG1发酵产2,3-丁二醇的影响 | 第71页 |
| 3.2.12 3.7升发酵罐实验 | 第71页 |
| 3.3 结果和讨论 | 第71-84页 |
| 3.3.1 基因slaR,swrI和swrR突变株的构建 | 第71-73页 |
| 3.3.1.1 slaR,swrI和swrR基因片段的扩增 | 第71-72页 |
| 3.3.1.2 自杀载体pUTKm-slaR,pUTKm-swrI和pUTKm-swrR的构建 | 第72-73页 |
| 3.3.1.3 slaR,swrI和swrR基因突变株的验证 | 第73页 |
| 3.3.2 slaR,swrI和swrR对细菌生长,乙偶姻和2,3-丁二醇合成的影响 | 第73-75页 |
| 3.3.2.1 slaR,swrI和swrR对于粘质沙雷氏菌生长的影响 | 第73-74页 |
| 3.3.2.2 slaR,swrI和swrR对粘质沙雷氏菌产酸的影响 | 第74-75页 |
| 3.3.2.3 slaR,swrI和swrR对于粘质沙雷氏菌合成乙偶姻、2,3-丁二醇的影响 | 第75页 |
| 3.3.3 slaR,swrI和swrR对2,3-丁二醇合成基因转录水平的调控 | 第75-80页 |
| 3.3.3.1 slaR突变株中2,3-丁二醇合成基因转录水平的变化 | 第75-76页 |
| 3.3.3.2 swrI突变株中2,3-丁二醇合成基因转录水平的变化 | 第76-77页 |
| 3.3.3.3 swrR突变株中2,3-丁二醇合成基因转录水平的变化 | 第77-80页 |
| 3.3.4 pH对2,3-丁二醇合成基因转录水平的影响 | 第80页 |
| 3.3.5 乙酸对于2,3-丁二醇合成基因转录水平的影响 | 第80-81页 |
| 3.3.6 2,3-丁二醇合成基因所受到的二元调控方式分析 | 第81-82页 |
| 3.3.7 swrR突变株的发酵实验 | 第82页 |
| 3.3.8 swrR突变株的摇瓶和3.7升发酵结果 | 第82-84页 |
| 3.4 本章小结 | 第84-85页 |
| 第四章 粘质沙雷氏菌中2,3-丁二醇脱氢酶的研究 | 第85-102页 |
| 4.1 引言 | 第85-86页 |
| 4.2 实验材料和方法 | 第86-90页 |
| 4.2.1 菌株,质粒和引物 | 第86页 |
| 4.2.2 实验所用试剂 | 第86页 |
| 4.2.3 培养基和抗生素 | 第86页 |
| 4.2.4 粘质沙雷氏菌MG1基因组DNA提取 | 第86页 |
| 4.2.5 2,3-丁二醇脱氢酶基因slaC,slaCS序列的获取 | 第86-87页 |
| 4.2.6 2,3-丁二醇脱氢酶基因slaCS的克隆与表达 | 第87-88页 |
| 4.2.6.1 PCR反应体系 | 第87页 |
| 4.2.6.2 PCR扩增条件 | 第87页 |
| 4.2.6.3 限制性酶切反应,纯化以及连接反应 | 第87-88页 |
| 4.2.6.4 连接反应体系 | 第88页 |
| 4.2.7 诱导表达 | 第88页 |
| 4.2.8 酶的纯化及透析 | 第88页 |
| 4.2.9 蛋白浓度的测定 | 第88-89页 |
| 4.2.10 电泳SDS-PAGE分析 | 第89页 |
| 4.2.11 生物信息学分析 | 第89页 |
| 4.2.12 2,3-丁二醇脱氢酶酶学性质研究 | 第89-90页 |
| 4.2.12.1 2,3-丁二醇脱氢酶酶活力单位的定义以及酶活力的测定 | 第89-90页 |
| 4.2.12.2 酶反应最适pH的测定 | 第90页 |
| 4.2.12.3 酶反应最适温度的测定 | 第90页 |
| 4.2.12.4 酶的热稳定性试验 | 第90页 |
| 4.2.12.5 酶动力学常数Km的测定 | 第90页 |
| 4.2.12.6 酶的底物特异性研究 | 第90页 |
| 4.3 结果和分析 | 第90-101页 |
| 4.3.1 slaCS基因的扩增 | 第90-91页 |
| 4.3.2 slaCS基因的序列和生物信息学分析 | 第91页 |
| 4.3.3 基因slaCS在大肠杆菌中的表达 | 第91页 |
| 4.3.4 重组质粒的双酶切验证及测序 | 第91-92页 |
| 4.3.5 2,3-丁二醇脱氢酶基因在大肠杆菌中的诱导表达 | 第92页 |
| 4.3.6 2,3-丁二醇脱氢酶的纯化 | 第92-93页 |
| 4.3.7 2,3-丁二醇脱氢酶SlaC和SlaCS的研究 | 第93-99页 |
| 4.3.7.1 酶反应最适温度 | 第93-94页 |
| 4.3.7.2 酶反应最适pH | 第94-96页 |
| 4.3.7.3 酶热稳定性的测定 | 第96-98页 |
| 4.3.7.4 酶动力学常数Km的测定 | 第98页 |
| 4.3.7.5 酶的底物特异性研究 | 第98-99页 |
| 4.3.8 两种2,3-丁二醇脱氢酶的比较 | 第99-101页 |
| 4.3.8.1 基因序列和同源性比较 | 第99-100页 |
| 4.3.8.2 2,3-丁二醇脱氢酶进化树的建立 | 第100页 |
| 4.3.8.3 酶学性质的比较 | 第100-101页 |
| 4.4 本章小结 | 第101-102页 |
| 第五章 粘质沙雷氏菌代谢工程研究 | 第102-119页 |
| 5.1 引言 | 第102页 |
| 5.2 菌株、质粒和引物 | 第102-109页 |
| 5.2.1 本章所用菌株、质粒和引物见表 | 第102-103页 |
| 5.2.2 实验所用仪器和试剂 | 第103页 |
| 5.2.3 培养基以及抗生素 | 第103页 |
| 5.2.4 大肠杆菌BL21和粘质沙雷氏菌基因组DNA的提取 | 第103页 |
| 5.2.5 基于群体感应效应的自诱导系统 | 第103-105页 |
| 5.2.6 自诱导载体pWN的构建 | 第105-107页 |
| 5.2.6.1 PCR反应体系 | 第106页 |
| 5.2.6.2 PCR扩增条件 | 第106页 |
| 5.2.6.3 限制性酶切反应,纯化以及连接反应 | 第106页 |
| 5.2.6.4 连接反应体系 | 第106-107页 |
| 5.2.6.5 重组质粒的验证和测序 | 第107页 |
| 5.2.7 pET载体的构建 | 第107页 |
| 5.2.8 两种质粒共转化粘质沙雷氏菌 | 第107-108页 |
| 5.2.8.1 粘质沙雷氏菌电转感受态细胞的制备 | 第107页 |
| 5.2.8.2 粘质沙雷氏菌电转化方法 | 第107-108页 |
| 5.2.9 粘质沙雷氏菌表达产物的检测 | 第108页 |
| 5.2.10 slaR过表达对粘质沙雷氏菌产2,3-丁二醇的影响 | 第108页 |
| 5.2.11 木糖异构酶基因和木酮糖激酶基因表达使粘质沙雷氏菌可以利用木糖 | 第108页 |
| 5.2.12 表达产物的SDS-PAGE分析 | 第108页 |
| 5.2.13 木糖异构酶和木酮糖激酶的酶活分析 | 第108-109页 |
| 5.3 实验结果 | 第109-118页 |
| 5.3.1 大肠杆菌中T7RNA聚合酶基因的扩增 | 第109-110页 |
| 5.3.2 载体pBT-T7RNA的构建 | 第110页 |
| 5.3.3 启动子slaA的克隆 | 第110-111页 |
| 5.3.4 载体pWN的构建 | 第111页 |
| 5.3.5 slaR在粘质沙雷氏菌MG1中的过表达情况分析 | 第111-112页 |
| 5.3.6 slaR过表达对粘质沙雷氏菌产乙偶姻和2,3-丁二醇的影响 | 第112-113页 |
| 5.3.7 重组菌3.7升发酵罐实验 | 第113-115页 |
| 5.3.8 利用木糖的粘质沙雷氏重组菌的构建 | 第115页 |
| 5.3.9 木糖异构酶和木酮糖激酶在粘质沙雷氏菌中的表达情况分析 | 第115-116页 |
| 5.3.10 重组菌利用木糖和利用蔗糖发酵2,3-丁二醇的对比 | 第116-117页 |
| 5.3.11 重组粘质沙雷氏菌中木糖代谢的酶活性测定 | 第117-118页 |
| 5.4 本章小结 | 第118-119页 |
| 第六章 总结和展望 | 第119-122页 |
| 6.1 论文总结 | 第119-120页 |
| 6.2 研究展望 | 第120-122页 |
| 参考文献 | 第122-133页 |
| 致谢 | 第133-134页 |
| 博士期间发表的论文与专利 | 第134-135页 |
| 附录 英文缩写 | 第135页 |
