| 摘要 | 第5-6页 |
| Abstract | 第6页 |
| 第一章 绪论 | 第10-20页 |
| 1.1 药物体外肝代谢模型研究现状 | 第10-12页 |
| 1.2 转座子概述 | 第12-15页 |
| 1.2.1 转座子的分类 | 第12-13页 |
| 1.2.2 piggyBac转座子与及作用机制 | 第13-15页 |
| 1.3 多基因共表达的研究进展 | 第15-18页 |
| 1.3.1 多基因共表达的研究现状 | 第15-16页 |
| 1.3.2 2A基因的作用机理和研究现状 | 第16-18页 |
| 1.4 本课题研究思路 | 第18-20页 |
| 第二章 重组转座子PB-CYP3A4-P2A-CYP2C19 的构建 | 第20-31页 |
| 2.1 实验材料 | 第20-21页 |
| 2.1.1 主要仪器和设备 | 第20页 |
| 2.1.2 菌株及质粒 | 第20页 |
| 2.1.3 主要实验试剂 | 第20-21页 |
| 2.1.4 实验相关试剂和培养基配制 | 第21页 |
| 2.2 实验方法 | 第21-26页 |
| 2.2.1 CYP3A4 和CYP2C19 基因的克隆 | 第22-25页 |
| 2.2.2 构建PB-CYP3A4-P2A-CYP2C19 重组转座子质粒 | 第25-26页 |
| 2.3 实验结果 | 第26-29页 |
| 2.3.1 CYP3A4 和CYP2C19 基因的克隆 | 第26-27页 |
| 2.3.2 重组质粒pMD-18T-CYP3A4-P2A-CYP2C19 双酶切鉴定 | 第27-28页 |
| 2.3.3 重组质粒PB-CYP3A4-P2A-CYP2C19 双酶切鉴定 | 第28-29页 |
| 2.4 讨论与小结 | 第29-31页 |
| 第三章 转座子介导HepG2 单克隆细胞系的建立 | 第31-44页 |
| 3.1 实验仪器与材料 | 第31-32页 |
| 3.1.1 主要仪器设备 | 第31页 |
| 3.1.2 实验材料 | 第31页 |
| 3.1.3 实验相关试剂配制 | 第31-32页 |
| 3.2 实验方法 | 第32-36页 |
| 3.2.1 无内毒素质粒的制备 | 第32页 |
| 3.2.2 筛选大片段质粒DNA转染HepG2 细胞最佳方法 | 第32-35页 |
| 3.2.3 Puromycin对HepG2 细胞毒性试验 | 第35页 |
| 3.2.4 质粒转染HepG2 细胞 | 第35-36页 |
| 3.2.5 抗性细胞克隆的获得 | 第36页 |
| 3.3 实验结果 | 第36-42页 |
| 3.3.1 无内毒素质粒DNA纯化试剂盒提取质粒和纯度测定 | 第36-37页 |
| 3.3.2 Puromycin对HepG2 细胞毒性试验结果 | 第37页 |
| 3.3.3 三种转染方法对HepG2 细胞转染效率比较 | 第37-41页 |
| 3.3.4 细胞单克隆化 | 第41-42页 |
| 3.4 讨论与小结 | 第42-44页 |
| 第四章 稳定表达人药物代谢酶HepG2 细胞系的鉴定及酶活性分析 | 第44-58页 |
| 4.1 实验仪器与材料 | 第44-46页 |
| 4.1.1 实验主要仪器 | 第44页 |
| 4.1.2 实验材料 | 第44-45页 |
| 4.1.3 实验试剂配制 | 第45-46页 |
| 4.2 实验方法 | 第46-53页 |
| 4.2.1 抗性细胞克隆转录水平鉴定 | 第46-49页 |
| 4.2.2 Western Blot检测药物代谢酶基因CYP3A4 和CYP2C19 基因表达 | 第49-50页 |
| 4.2.3 LC-MS/MS测定单克隆细胞对睾酮和美分妥因代谢能力 | 第50-53页 |
| 4.3 实验结果 | 第53-57页 |
| 4.3.1 细胞总RNA电泳检测 | 第53页 |
| 4.3.2 CYP3A4,CYP2C19 基因mRNA水平Real-Time PCR检测结果 | 第53-54页 |
| 4.3.3 BCA法测细胞中蛋白浓度 | 第54页 |
| 4.3.4 Western blot结果 | 第54-55页 |
| 4.3.5 CYP3A4 和CYP2C19 表达蛋白活性测定 | 第55-57页 |
| 4.4 讨论与小结 | 第57-58页 |
| 结论与展望 | 第58-61页 |
| 参考文献 | 第61-67页 |
| 附录 CYP3A4-P2A-CYP2C19 基因测序结果比对 | 第67-73页 |
| 攻读博士/硕士学位期间取得的研究成果 | 第73-74页 |
| 致谢 | 第74-75页 |
| 附件 | 第75页 |
