| 摘要 | 第3-5页 |
| abstract | 第5-6页 |
| 第1章 引言 | 第11-21页 |
| 1 抗菌肽简介 | 第11页 |
| 2 鲎素的研究情况 | 第11-19页 |
| 2.1 鲎素分子结构和生物活性 | 第12-14页 |
| 2.2 鲎素的作用机制 | 第14-15页 |
| 2.3 鲎素的基因工程表达 | 第15-16页 |
| 2.4 鲎素发展应用中存在的问题 | 第16-18页 |
| 2.5 鲎素类肽的应用 | 第18-19页 |
| 3 毕赤酵母菌的基因工程应用 | 第19-20页 |
| 3.1 毕赤酵母真核表达系统简介 | 第19页 |
| 3.2 毕赤酵母菌表达系统的应用 | 第19-20页 |
| 4 课题研究的来源、目的及意义 | 第20-21页 |
| 4.1 课题来源 | 第20页 |
| 4.2 研究目的和意义 | 第20-21页 |
| 第2章 TP-Ⅰ基因序列设计及其重组构建 | 第21-33页 |
| 1 实验材料 | 第21-23页 |
| 1.1 质粒和菌株 | 第21页 |
| 1.2 试剂 | 第21-22页 |
| 1.3 仪器设备 | 第22页 |
| 1.4 培养基和溶液配制 | 第22-23页 |
| 2 实验方法 | 第23-28页 |
| 2.1 大肠杆菌TOP 10F’感受态细胞的制备 | 第23页 |
| 2.2 pGAPZαB质粒的转化与筛选 | 第23-24页 |
| 2.3 pGAPZαB质粒的提取与鉴定 | 第24-25页 |
| 2.4 限制性内切酶酶切反应 | 第25-26页 |
| 2.5 酶切片段的胶分离回收 | 第26页 |
| 2.6 4TP-Ⅰ与pGAPZαB的酶连反应 | 第26-27页 |
| 2.7 重组质粒pGAPZαB-4TP-Ⅰ的转化与筛选 | 第27-28页 |
| 3 结果与分析 | 第28-32页 |
| 3.1 重组串联鲎素肽氨基酸序列设计 | 第28-29页 |
| 3.2 重组串联TP-Ⅰ表达载体pGAPZαB-4TP-Ⅰ的构建 | 第29-32页 |
| 3.3 目的基因测序结果 | 第32页 |
| 4 小结 | 第32-33页 |
| 第3章 TP-Ⅰ毕赤酵母真核表达系统的构建 | 第33-48页 |
| 1 实验材料 | 第33-36页 |
| 1.1 质粒和菌株 | 第33页 |
| 1.2 试剂 | 第33-34页 |
| 1.3 仪器设备 | 第34-35页 |
| 1.4 培养基和溶液配制 | 第35-36页 |
| 2 实验方法 | 第36-43页 |
| 2.1 工程菌GS115对化学合成TP-Ⅰ的耐受情况测定 | 第36页 |
| 2.2 重组质粒pGAPZαB-4TP-Ⅰ的大量提取 | 第36-37页 |
| 2.3 重组质粒pGAPZαB-4TP-Ⅰ的线性化与鉴定 | 第37-38页 |
| 2.4 重组质粒pGAPZαB-4TP-Ⅰ的纯化与浓缩 | 第38页 |
| 2.5 毕赤酵母菌GS115感受态细胞的制备 | 第38页 |
| 2.6 毕赤酵母菌的电转化 | 第38-39页 |
| 2.7 组成型阳性菌株的筛选 | 第39页 |
| 2.8 毕赤酵母菌基因组DNA的提取 | 第39-40页 |
| 2.9 插入重组质粒片段的PCR鉴定 | 第40-41页 |
| 2.10 上清中表达产物的Tri-SDS-PAGE电泳 | 第41-42页 |
| 2.11 高效表达鲎素菌株的筛选 | 第42-43页 |
| 3 结果与分析 | 第43-47页 |
| 3.1 工程菌GS115对化学合成TP-Ⅰ的耐受程度 | 第43页 |
| 3.2 pGAPZαB-4TP-Ⅰ的线性化结果 | 第43-44页 |
| 3.3 组成型阳性菌株的筛选结果 | 第44-45页 |
| 3.4 插入重组质粒片段的PCR与测序结果 | 第45-46页 |
| 3.5 高效表达重组串联鲎素肽菌株的筛选结果 | 第46-47页 |
| 4 小结 | 第47-48页 |
| 第4章 重组TP-Ⅰ工程菌发酵产物分离纯化及生物活性分析 | 第48-60页 |
| 1 实验材料 | 第48-50页 |
| 1.1 质粒和菌株 | 第48页 |
| 1.2 试剂 | 第48-49页 |
| 1.3 仪器设备 | 第49页 |
| 1.4 培养基和溶液配制 | 第49-50页 |
| 2 实验方法 | 第50-53页 |
| 2.1 工程菌GS115-GAPZαB-4TP-Ⅰ的生长曲线测定 | 第50页 |
| 2.2 融合串联多肽6His-4TP-Ⅰ的Ni-IDA亲和层析柱纯化 | 第50-51页 |
| 2.3 串联重组TP-Ⅰ的胰肽酶E酶解 | 第51页 |
| 2.4 SephadexG-25填料去除胰肽酶E | 第51-52页 |
| 2.5 重组TP-Ⅰ单体的羧肽酶A酶解 | 第52页 |
| 2.6 重组TP-Ⅰ单体含量测定 | 第52-53页 |
| 2.7 重组TP-Ⅰ对各菌的抑菌实验 | 第53页 |
| 3 结果与分析 | 第53-58页 |
| 3.1 工程菌GS115-GAPZαB-4TP-Ⅰ生长曲线测定结果 | 第53-54页 |
| 3.2 亲和层析纯化融合多肽6His-4TP-Ⅰ的Tri-SDS-PAGE电泳结果 | 第54-55页 |
| 3.3 串联重组TP-Ⅰ的胰肽酶E酶解结果 | 第55页 |
| 3.4 重组TP-Ⅰ单体含量测定结果 | 第55-57页 |
| 3.5 重组TP-Ⅰ生物活性 | 第57-58页 |
| 4 小结 | 第58-60页 |
| 第5章 研究结论与展望 | 第60-62页 |
| 1 结论 | 第60-61页 |
| 2 研究展望 | 第61-62页 |
| 致谢 | 第62-63页 |
| 参考文献 | 第63-68页 |
| 附录A：pGAPZαB-4TP-Ⅰ质粒测序图 | 第68-70页 |
| 附录B：重组GS115基因组PCR产物测序图 | 第70-71页 |
| 附录C：重组TP-Ⅰ单体的质谱分析结果 | 第71-72页 |
| 附录D：重组TP-Ⅰ单体的RP-HPLC分析结果 | 第72-73页 |
| 攻读学位期间的研究成果 | 第73页 |
