| 摘要 | 第2-3页 |
| Abstract | 第3-4页 |
| 符号说明 | 第8-10页 |
| 综述 | 第10-17页 |
| 参考文献 | 第14-17页 |
| 前言 | 第17-19页 |
| 参考文献 | 第17-19页 |
| 第一部分 PP65基因克隆与原核表达载体的构建 | 第19-35页 |
| 材料与方法 | 第19-33页 |
| 1.材料 | 第19-22页 |
| 1.1 毒株、菌株及载体 | 第19-20页 |
| 1.2 试剂与设备 | 第20页 |
| 1.3 引物合成与DNA测序 | 第20页 |
| 1.4 主要仪器设备 | 第20页 |
| 1.5 试剂盒 | 第20页 |
| 1.6 主要试剂配方 | 第20-22页 |
| 2.方法 | 第22-28页 |
| 2.1 HCMV病毒的收集 | 第22-23页 |
| 2.1.1 HELF细胞的复苏与传代 | 第22页 |
| 2.1.2 HCMV病毒的培养 | 第22-23页 |
| 2.2 HCMV病毒DNA模板的提取 | 第23页 |
| 2.3 pGEX-4T-1/PP65重组质粒的构建 | 第23-26页 |
| 2.3.1 人巨细胞病毒表面抗原PP65基因的PCR扩增 | 第23-24页 |
| 2.3.2 PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳 | 第24页 |
| 2.3.3 pGEX-4T-1载体质粒DNA的提取 | 第24-25页 |
| 2.3.4 PCR纯化产物与载体质粒DNA的双酶切及纯化回收 | 第25-26页 |
| 2.3.5 PP65和pGEX-4T-1的连接 | 第26页 |
| 2.4 重组质粒pGEX-4T-1/PP65的转化 | 第26-27页 |
| 2.4.1 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备 | 第26-27页 |
| 2.4.2 重组质粒转化大肠杆菌 | 第27页 |
| 2.5 pGEX-4T-1/PP65重组质粒的鉴定 | 第27-28页 |
| 2.5.1 pGEX-4T-1/PP65重组质粒DNA的提取 | 第27页 |
| 2.5.2 重组质粒的PCR与双酶切鉴定 | 第27-28页 |
| 2.5.3 pGEX-4T-1/PP65重组质粒DNA的测序鉴定 | 第28页 |
| 2.5.4 pGEX-4T-1/PP65重组质粒的保种 | 第28页 |
| 3.结果 | 第28-33页 |
| 3.1 正常的HELF细胞与产生细胞病变效应的HELF细胞 | 第28-29页 |
| 3.2 PCR扩增PP65目的基因片段 | 第29-30页 |
| 3.3 重组质粒的构建 | 第30-31页 |
| 3.4 原核表达载体pGEX-4T-1/PP65的鉴定 | 第31-32页 |
| 3.5 重组质粒测序鉴定 | 第32页 |
| 3.6 目的氨基酸序列的抗原性预测 | 第32-33页 |
| 4.讨论 | 第33页 |
| 参考文献 | 第33-35页 |
| 第二部分 pp65蛋白的可溶性表达及鉴定 | 第35-51页 |
| 1.材料 | 第35-38页 |
| 1.1 生物材料及来源 | 第35页 |
| 1.2 生化试剂及部分配制方法 | 第35-38页 |
| 1.3 主要仪器设备 | 第38页 |
| 1.4 试剂盒 | 第38页 |
| 2.方法 | 第38-43页 |
| 2.1 重组质粒转化入宿主菌 | 第38-39页 |
| 2.1.1 大肠杆菌BL21(DE3)感受态的制备 | 第38-39页 |
| 2.1.2 pGEX-4T-1/PP65重组质粒转化入宿主菌 | 第39页 |
| 2.1.3 pGEX-4T-1载体质粒转化入宿主菌 | 第39页 |
| 2.2 pGEX-4T-1/PP65重组质粒的诱导表达 | 第39-40页 |
| 2.2.1 少量诱导 | 第39页 |
| 2.2.2 大量诱导 | 第39-40页 |
| 2.3 表达产物的SDS-PAGE检测 | 第40页 |
| 2.3.1 样品的处理 | 第40页 |
| 2.3.2 SDS聚丙烯酰胺凝胶的配制 | 第40页 |
| 2.3.3 电泳检测 | 第40页 |
| 2.4 表达产物的定位 | 第40-41页 |
| 2.5 表达产物的GST蛋白纯化柱纯化 | 第41页 |
| 2.6 间接ELISA法检测GST/pp65融合蛋白活性 | 第41-42页 |
| 2.7 Western Blot检测GST/pp65融合蛋白活性 | 第42-43页 |
| 2.8 GST/pp65蛋白和GST/gB蛋白混合抗原的特性鉴定 | 第43页 |
| 3.结果 | 第43-49页 |
| 3.1 蛋白诱导表达产物的SDS-PAGE电泳检测 | 第43-45页 |
| 3.1.1 少量诱导SDS-PAGE电泳检测 | 第43-44页 |
| 3.1.2 大量诱导SDS-PAGE电泳 | 第44-45页 |
| 3.2 表达产物的纯化 | 第45-46页 |
| 3.3 GST/pp65融合蛋白和GST蛋白的特性鉴定 | 第46-48页 |
| 3.4 GST/pp65蛋白和GST/gB蛋白混合抗原的特性鉴定 | 第48-49页 |
| 3.5 GST/pp65蛋白的Western Blot结果 | 第49页 |
| 4.讨论 | 第49-50页 |
| 参考文献 | 第50-51页 |
| 第三部分 pp65ELISA试剂盒的初步应用 | 第51-55页 |
| 1.血清与材料 | 第51页 |
| 2.方法 | 第51-52页 |
| 2.1 自制pp65 ELISA试剂盒 | 第51页 |
| 2.2 自制pp65+gB ELISA试剂盒 | 第51页 |
| 2.3 临床检测 | 第51-52页 |
| 2.4 自制试剂盒特异性检测 | 第52页 |
| 3.试验结果 | 第52-53页 |
| 4.讨论 | 第53页 |
| 参考文献 | 第53-55页 |
| 致谢 | 第55-56页 |
