| 摘要 | 第5-6页 |
| Abstract | 第6页 |
| 第1章 绪论 | 第11-23页 |
| 1.1 概述 | 第11页 |
| 1.2 外源蛋白在E.coli中的可溶表达策略 | 第11-15页 |
| 1.2.1 选择合适的宿主 | 第12页 |
| 1.2.2 分泌型表达 | 第12-13页 |
| 1.2.3 融合型表达 | 第13页 |
| 1.2.4 与分子伴侣共表达 | 第13页 |
| 1.2.5 控制蛋白质表达水平 | 第13-14页 |
| 1.2.6 改造蛋白质 | 第14页 |
| 1.2.7 优化培养基 | 第14-15页 |
| 1.2.8 优化发酵条件 | 第15页 |
| 1.3 融合标签的研究进展 | 第15-18页 |
| 1.3.1 促溶标签 | 第15-17页 |
| 1.3.2 沉淀标签 | 第17-18页 |
| 1.4 标签切除方法研究进展 | 第18-19页 |
| 1.4.1 蛋白酶切 | 第18页 |
| 1.4.2 化学裂解 | 第18页 |
| 1.4.3 标签自裂解 | 第18-19页 |
| 1.5 重组蛋白纯化策略 | 第19-20页 |
| 1.5.1 亲和色谱 | 第19页 |
| 1.5.2 疏水相互作用色谱 | 第19-20页 |
| 1.5.3 分子排阻色谱 | 第20页 |
| 1.5.4 离子交换色谱 | 第20页 |
| 1.6 TRAIL的研究进展 | 第20-22页 |
| 1.6.1 TRAIL的简介 | 第20-21页 |
| 1.6.2 TRAIL的可溶表达 | 第21-22页 |
| 1.7 本课题的研究背景、意义及内容 | 第22-23页 |
| 1.7.1 本课题的研究背景、意义 | 第22页 |
| 1.7.2 本课题的研究内容 | 第22-23页 |
| 第2章 采用Fh8标签在E.coli中制备可溶TRAIL蛋白 | 第23-44页 |
| 2.1 引言 | 第23页 |
| 2.2 材料与方法 | 第23-36页 |
| 2.2.1 质粒、基因和菌株 | 第23页 |
| 2.2.2 细胞株 | 第23页 |
| 2.2.3 主要仪器 | 第23-24页 |
| 2.2.4 主要试剂 | 第24-25页 |
| 2.2.5 主要溶液的配制 | 第25-28页 |
| 2.2.6 主要软件 | 第28页 |
| 2.2.7 实验流程 | 第28页 |
| 2.2.8 实验方法 | 第28-36页 |
| 2.3 实验结果与讨论 | 第36-43页 |
| 2.3.1 PCR扩增目的基因 | 第36页 |
| 2.3.2 融合PCR扩增 | 第36-37页 |
| 2.3.3 重组菌的验证 | 第37页 |
| 2.3.4 重组菌的诱导表达 | 第37-38页 |
| 2.3.5 融合蛋白的纯化 | 第38-39页 |
| 2.3.6 酶切及酶切后纯化 | 第39-41页 |
| 2.3.7 western blot鉴定 | 第41页 |
| 2.3.8 MTT活性检测 | 第41-43页 |
| 2.4 本章小结 | 第43-44页 |
| 第3章 采用新型Fh8-ΔI-CM标签自切除系统在E.coli中制备可溶TRAIL蛋白 | 第44-56页 |
| 3.1 引言 | 第44页 |
| 3.2 材料与方法 | 第44-48页 |
| 3.2.1 质粒、基因和菌株 | 第44-45页 |
| 3.2.2 细胞株 | 第45页 |
| 3.2.3 主要仪器 | 第45页 |
| 3.2.4 主要试剂 | 第45页 |
| 3.2.5 主要溶液的配制 | 第45页 |
| 3.2.6 主要软件 | 第45页 |
| 3.2.7 重组载体的构建 | 第45-46页 |
| 3.2.8 重组载体的转化及验证 | 第46页 |
| 3.2.9 重组蛋白的表达及验证 | 第46页 |
| 3.2.10 标签自切除效率的研究 | 第46-47页 |
| 3.2.11 柱上标签切除和纯化 | 第47-48页 |
| 3.2.12 进一步纯化 | 第48页 |
| 3.2.13 Western blot鉴定 | 第48页 |
| 3.2.14 MTT法检测 | 第48页 |
| 3.3 实验结果与讨论 | 第48-54页 |
| 3.3.1 PCR扩增 | 第48页 |
| 3.3.2 融合PCR | 第48-49页 |
| 3.3.3 重组菌的验证 | 第49页 |
| 3.3.4 重组菌的诱导表达 | 第49-50页 |
| 3.3.5 标签自切除效率研究 | 第50-52页 |
| 3.3.6 柱上标签切除和纯化 | 第52页 |
| 3.3.7 进一步纯化 | 第52-53页 |
| 3.3.8 Western blot鉴定 | 第53-54页 |
| 3.3.9 MTT法检测 | 第54页 |
| 3.4 本章小结 | 第54-56页 |
| 第4章 融合蛋白Fh8-ΔI-CM-TRAIL可溶表达的优化 | 第56-68页 |
| 4.1 引言 | 第56页 |
| 4.2 材料与方法 | 第56-59页 |
| 4.2.1 质粒与菌株 | 第56页 |
| 4.2.2 实验器材 | 第56页 |
| 4.2.3 主要试剂 | 第56页 |
| 4.2.4 培养基的配制 | 第56页 |
| 4.2.5 主要软件 | 第56页 |
| 4.2.6 蛋白表达及鉴定 | 第56页 |
| 4.2.7 培养基成分的优化 | 第56-58页 |
| 4.2.8 菌株生长阶段的优化 | 第58页 |
| 4.2.9 蛋白表达阶段的优化 | 第58页 |
| 4.2.10 正交实验设计 | 第58-59页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第59-66页 |
| 4.3.1 单一有机氮源对Fh8-AI-CM-TRAIL融合蛋白可溶表达的影响 | 第59页 |
| 4.3.2 复合有机氮源对Fh8-ΔI-CM-TRAIL融合蛋白可溶表达的影响 | 第59-60页 |
| 4.3.3 装液量对Fh8-ΔI-CM-TRAIL融合蛋白可溶表达的影响 | 第60-61页 |
| 4.3.4 接种量对Fh8-ΔI-CM-TRAIL融合蛋白可溶表达的影响 | 第61页 |
| 4.3.5 诱导时菌浓对Fh8-ΔI-CM-TRAIL融合蛋白可溶表达的影响 | 第61-62页 |
| 4.3.6 Zn~(2+)浓度对Fh8-ΔI-CM-TRAIL融合蛋白可溶表达的影响 | 第62-63页 |
| 4.3.7 IPTG浓度对Fh8-ΔI-CM-TRAIL融合蛋白可溶表达的影响 | 第63页 |
| 4.3.8 诱导温度对Fh8-ΔI-CM-TRAIL融合蛋白可溶表达的影响 | 第63-64页 |
| 4.3.9 诱导时间对Fh8-ΔI-CM-TRAIL融合蛋白可溶表达的影响 | 第64页 |
| 4.3.10 正交实验分析 | 第64-66页 |
| 4.4 小结 | 第66-68页 |
| 第5章 总结与展望 | 第68-70页 |
| 5.1 总结 | 第68-69页 |
| 5.1.1 采用Fh8标签在E.coli中制备可溶TRAIL蛋白 | 第68页 |
| 5.1.2 采用Fh8-AI-CM标签自切除系统在E.coli中制备可溶TRAIL蛋白 | 第68页 |
| 5.1.3 融合蛋白Fh8-ΔI-CM-TRAIL可溶表达的优化 | 第68-69页 |
| 5.2 展望 | 第69-70页 |
| 参考文献 | 第70-76页 |
| 致谢 | 第76-77页 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 | 第77页 |
