| 摘要 | 第9-12页 |
| ABSTRACT | 第12-14页 |
| 缩略词表 | 第15-18页 |
| 1 前言 | 第18-56页 |
| 1.1 病原学 | 第18-20页 |
| 1.2 流行病学 | 第20-23页 |
| 1.2.1 动物炭疽 | 第20-21页 |
| 1.2.2 人型炭疽 | 第21-23页 |
| 1.3 炭疽病的诊断 | 第23-25页 |
| 1.3.1 细菌学诊断 | 第23页 |
| 1.3.2 分子生物学检测 | 第23-24页 |
| 1.3.3 免疫学检测 | 第24页 |
| 1.3.4 化学分析检测 | 第24-25页 |
| 1.3.5 其它检测方法 | 第25页 |
| 1.4 炭疽杆菌致病因子 | 第25-32页 |
| 1.4.1 荚膜 | 第25-26页 |
| 1.4.2 外毒素 | 第26-31页 |
| 1.4.2.1 保护性抗原 | 第27-28页 |
| 1.4.2.2 致死因子 | 第28-31页 |
| 1.4.2.3 水肿因子 | 第31页 |
| 1.4.3 其它致病因子 | 第31-32页 |
| 1.5 外毒素作用机理 | 第32-41页 |
| 1.5.1 PA与受体结合 | 第33-36页 |
| 1.5.1.1 炭疽毒素受体 | 第33-34页 |
| 1.5.1.2 PA83结合ATR | 第34-36页 |
| 1.5.2 PA83激活 | 第36页 |
| 1.5.3 Prepore形成 | 第36-37页 |
| 1.5.4 毒素复合体形成 | 第37-38页 |
| 1.5.5 复合体进入细胞 | 第38-39页 |
| 1.5.6 LF/EF转运 | 第39-40页 |
| 1.5.6.1 跨膜通道形成 | 第39-40页 |
| 1.5.6.2 LF/EF的运输 | 第40页 |
| 1.5.7 LF/EF的催化作用 | 第40-41页 |
| 1.6 炭疽的预防与治疗 | 第41-43页 |
| 1.6.1 炭疽预防 | 第41页 |
| 1.6.2 炭疽治疗 | 第41-43页 |
| 1.6.2.1 抗菌治疗 | 第41-42页 |
| 1.6.2.2 抗毒素治疗 | 第42-43页 |
| 1.7 炭疽疫苗 | 第43-49页 |
| 1.7.1 兽用疫苗 | 第44页 |
| 1.7.2 人用炭疽疫苗 | 第44-45页 |
| 1.7.3 新型炭疽疫苗 | 第45-49页 |
| 1.7.3.1 新型活菌疫苗 | 第45-46页 |
| 1.7.3.2 重组AP疫苗 | 第46-47页 |
| 1.7.3.3 荚膜结合疫苗 | 第47-48页 |
| 1.7.3.4 DNA疫苗 | 第48-49页 |
| 1.8 新型抗毒素的研究 | 第49-55页 |
| 1.8.1 阻断PA结合ATR | 第50页 |
| 1.8.2 阻断PA的激活 | 第50-51页 |
| 1.8.3 阻断LF/EF结合PA | 第51-52页 |
| 1.8.4 阻断毒素复合体的内吞 | 第52页 |
| 1.8.5 阻断prepore-pore的转化 | 第52-53页 |
| 1.8.6 阻断LF/EF的转运 | 第53页 |
| 1.8.7 阻断LF/EF对底物的修饰 | 第53-55页 |
| 1.9 本研究的目的与意义 | 第55-56页 |
| 2 炭疽水肿因子的重组表达与纯化及活性分析 | 第56-76页 |
| 2.1 实验材料 | 第57-63页 |
| 2.1.1 菌株,质粒和细胞株 | 第57页 |
| 2.1.2 主要试剂 | 第57-58页 |
| 2.1.3 培养基及抗生素的配置 | 第58-59页 |
| 2.1.4 主要溶液的配置 | 第59-62页 |
| 2.1.4.1 感受态制备相关溶液 | 第59页 |
| 2.1.4.2 质粒抽提相关缓冲液 | 第59-60页 |
| 2.1.4.3 SDS-PAGE缓冲液 | 第60页 |
| 2.1.4.4 Native-PAGE缓冲液 | 第60-61页 |
| 2.1.4.5 Western blot缓冲液及试剂 | 第61页 |
| 2.1.4.6 ELISA相关缓冲液 | 第61-62页 |
| 2.1.5 引物 | 第62页 |
| 2.1.6 实验动物 | 第62页 |
| 2.1.7 主要仪器设备 | 第62-63页 |
| 2.2 试验方法 | 第63-70页 |
| 2.2.1 EF表达载体的构建 | 第63-65页 |
| 2.2.1.1 cya的扩增 | 第63页 |
| 2.2.1.2 PCR产物的纯化与酶切 | 第63-64页 |
| 2.2.1.3 PCR产物与载体的连接 | 第64页 |
| 2.2.1.4 E. coli DH5α感受受态细胞的制备 | 第64页 |
| 2.2.1.5 连接产物的转化 | 第64页 |
| 2.2.1.6 质粒的制备与检测 | 第64-65页 |
| 2.2.1.7 重组质粒的酶切鉴定 | 第65页 |
| 2.2.1.8 重组质粒的测序鉴定 | 第65页 |
| 2.2.2 重组EF的表达与纯化 | 第65-67页 |
| 2.2.2.1 表达宿主感受态细胞的制备 | 第65-66页 |
| 2.2.2.2 电击转化表达宿主 | 第66页 |
| 2.2.2.3 SDS-PAGE凝胶的制备 | 第66页 |
| 2.2.2.4 电泳、染色及脱色 | 第66-67页 |
| 2.2.2.5 EF表达与纯化 | 第67页 |
| 2.2.3 重组PA的纯化 | 第67-68页 |
| 2.2.4 重组LF的纯化 | 第68-69页 |
| 2.2.5 炭疽毒素的生物活性测定 | 第69-70页 |
| 2.2.5.1 细胞培养 | 第69页 |
| 2.2.5.2 PA与LF生物活性分析 | 第69页 |
| 2.2.5.3 EF活性分析 | 第69-70页 |
| 2.3 结果与分析 | 第70-74页 |
| 2.3.1 EF表达载体的构建 | 第70-71页 |
| 2.3.2 EF的重组表达与纯化 | 第71-73页 |
| 2.3.3 PA和LF的纯化 | 第73页 |
| 2.3.4 炭疽外毒素的生物活性分析 | 第73-74页 |
| 2.4 讨论 | 第74-76页 |
| 3 保护性抗原的体外分子改良与筛选 | 第76-99页 |
| 3.1 实验材料 | 第78页 |
| 3.2 实验方法 | 第78-85页 |
| 3.2.1 PA突变体库的构建 | 第78-81页 |
| 3.2.1.1 KpnI酶切位点的引入 | 第78-80页 |
| 3.2.1.2 PA_K和GST-PA活性分析 | 第80页 |
| 3.2.1.3 Error-prone PCR法构建突变体文库 | 第80-81页 |
| 3.2.2 显性抑制突变体(DN-PA)的筛选 | 第81-82页 |
| 3.2.2.1 E.coli T7噬菌体制备 | 第81页 |
| 3.2.2.2 DN-PA的筛选 | 第81-82页 |
| 3.2.3 显性抑制活性分析 | 第82-83页 |
| 3.2.4 动物保护分析 | 第83页 |
| 3.2.5 LFn克隆,表达与纯化 | 第83-84页 |
| 3.2.5.1 LFn的克隆 | 第83页 |
| 3.2.5.2 LFn表达与纯化 | 第83-84页 |
| 3.2.6 DN-PA功能分析 | 第84-85页 |
| 3.2.6.1 体外胰蛋白酶切割分析 | 第84页 |
| 3.2.6.2 (PA63)_7-LFn形成能力分析 | 第84页 |
| 3.2.6.3 (PA63)_7-LFn对SDS耐受性分析 | 第84-85页 |
| 3.3 实验结果 | 第85-94页 |
| 3.3.1 PA突变体库构建 | 第85-87页 |
| 3.3.1.1 KpnI酶切位点的引入 | 第85-86页 |
| 3.3.1.2 PA_K和GST-PA活性分析 | 第86-87页 |
| 3.3.2 DN-PA的筛选 | 第87-88页 |
| 3.3.3 显性抑制活性分析 | 第88-90页 |
| 3.3.4 动物保护分析 | 第90页 |
| 3.3.5 LFn的克隆,表达和纯化 | 第90-92页 |
| 3.3.5.1 LFn表达载体的构建 | 第91-92页 |
| 3.3.5.2 LFn的表达和纯化 | 第92页 |
| 3.3.6 DN-PA功能分析 | 第92-94页 |
| 3.3.6.1 Trypsin切割分析 | 第92-93页 |
| 3.3.6.2 (PA63)_7-LFn形成能力分析 | 第93页 |
| 3.3.6.3 (PA63)_7-LFn对SDS耐受性分析 | 第93-94页 |
| 3.4 讨论与分析 | 第94-99页 |
| 3.4.1 突变体库的构建与筛选 | 第94-95页 |
| 3.4.2 氨基酸V377,T380,I432和N435的功能 | 第95-98页 |
| 3.4.3 显性抑制突变体的应用潜力 | 第98-99页 |
| 4 一种单成份双靶点抗毒素和三价疫苗构建与评估 | 第99-120页 |
| 4.1 实验材料与方法 | 第101页 |
| 4.2 实验方法 | 第101-107页 |
| 4.2.1 表达载体的构建 | 第101-103页 |
| 4.2.2 蛋白的表达,纯化与鉴定 | 第103-104页 |
| 4.2.2.1 融合蛋白的表达与纯化 | 第103页 |
| 4.2.2.2 融合蛋白Western blot鉴定 | 第103-104页 |
| 4.2.3 融合体对Trypsin敏感性检测 | 第104页 |
| 4.2.4 细胞毒性分析 | 第104-105页 |
| 4.2.5 体外抗毒素活性检测 | 第105页 |
| 4.2.6 体内抗毒素活性检测 | 第105-106页 |
| 4.2.7 动物免疫试验 | 第106页 |
| 4.2.8 抗体滴度检测 | 第106页 |
| 4.2.9 免疫小鼠攻毒实验 | 第106-107页 |
| 4.2.10 数据统计分析 | 第107页 |
| 4.3 结果与分析 | 第107-115页 |
| 4.3.1 融合体的构建 | 第107-108页 |
| 4.3.2 蛋白的表达、纯化与鉴定 | 第108-109页 |
| 4.3.3 融合体对Trypsin敏感性检测 | 第109-111页 |
| 4.3.4 细胞毒性检测 | 第111-112页 |
| 4.3.5 体外抗毒素活性检测 | 第112-113页 |
| 4.3.6 体内抗毒素活性分析 | 第113页 |
| 4.3.7 LFn-DPA免疫原性评估 | 第113-115页 |
| 4.3.8 LFn-DPA对小鼠的免疫保护力评估 | 第115页 |
| 4.4 讨论 | 第115-120页 |
| 4.4.1 LFn-DPA可作为一种双靶点炭疽抗毒素 | 第115-117页 |
| 4.4.2 LFn-DPA可作为一种三价炭疽疫苗 | 第117-120页 |
| 5 总结 | 第120-121页 |
| 参考文献 | 第121-145页 |
| 致谢 | 第145-146页 |
| 附录一 质粒图谱 | 第146-149页 |
| 附录二 研究生期间发表文章 | 第149页 |
