对海南地区Bt菌株cry基因的鉴定、克隆及蛋白活性分析
| 摘要 | 第10-12页 |
| 英文摘要 | 第12-13页 |
| 1 前言 | 第14-25页 |
| 1.1 苏云金芽胞杆菌介绍 | 第14页 |
| 1.2 杀虫晶体蛋白的命名 | 第14-15页 |
| 1.3 δ-内毒素的结构功能 | 第15-17页 |
| 1.3.1 Cry蛋白 | 第15-17页 |
| 1.3.2 Cyt蛋白 | 第17页 |
| 1.4 细胞外毒素 | 第17-19页 |
| 1.4.1 分泌蛋白 | 第18页 |
| 1.4.2 Sip蛋白 | 第18-19页 |
| 1.5 苏云金芽胞杆菌杀虫机制 | 第19页 |
| 1.6 杀虫基因的鉴定方法 | 第19-22页 |
| 1.6.1 基于PCR技术的鉴定方法 | 第20页 |
| 1.6.2 多重PCR方法 | 第20页 |
| 1.6.3 PCR-RFLP方法 | 第20页 |
| 1.6.4 Exclusive PCR方法 | 第20-21页 |
| 1.6.5 PCR-高分辨率溶解分析 | 第21页 |
| 1.6.6 PCR-高通量测序法 | 第21页 |
| 1.6.7 基因组测序 | 第21-22页 |
| 1.6.8 杀虫蛋白鉴定 | 第22页 |
| 1.7 鳞翅目农业害虫的防治 | 第22页 |
| 1.8 苏云金芽胞杆菌的应用 | 第22-24页 |
| 1.8.1 Bt杀虫剂 | 第23页 |
| 1.8.2 转Bt基因工程菌 | 第23页 |
| 1.8.3 转Bt基因作物 | 第23-24页 |
| 1.9 本研究的立题依据和目的意义 | 第24-25页 |
| 2 实验材料与方法 | 第25-37页 |
| 2.1 实验材料 | 第25-29页 |
| 2.1.1 菌株与质粒 | 第25页 |
| 2.1.2 培养基 | 第25-26页 |
| 2.1.3 抗生素 | 第26页 |
| 2.1.4 酶与生化试剂 | 第26页 |
| 2.1.5 常用溶液与缓冲液 | 第26-28页 |
| 2.1.6 仪器设备 | 第28页 |
| 2.1.7 供试昆虫 | 第28-29页 |
| 2.2 实验方法 | 第29-37页 |
| 2.2.1 样品采集与菌株分离 | 第29页 |
| 2.2.2 Bt基因组提取 | 第29页 |
| 2.2.3 引物设计与基因扩增 | 第29-30页 |
| 2.2.4 琼脂糖凝胶电泳检测 | 第30-31页 |
| 2.2.5 DNA回收 | 第31页 |
| 2.2.6 E. coli感受态的制备 | 第31页 |
| 2.2.7 E. coli 的热激转化 | 第31页 |
| 2.2.8 连接反应 | 第31-32页 |
| 2.2.9 E. coli质粒DNA提取 | 第32页 |
| 2.2.10 基因的全长扩增 | 第32-33页 |
| 2.2.11 酶切与连接 | 第33页 |
| 2.2.12 菌液PCR鉴定 | 第33页 |
| 2.2.13 重组质粒的提取及测序 | 第33页 |
| 2.2.14 基因表达载体构建 | 第33-34页 |
| 2.2.15 基因在大肠杆菌中的表达 | 第34页 |
| 2.2.16 Bt菌株Cry总蛋白的提取 | 第34-35页 |
| 2.2.17 SDS-PAGE电泳分析及蛋白定量 | 第35-36页 |
| 2.2.18 蛋白的生物活性测定 | 第36-37页 |
| 3 结果与分析 | 第37-48页 |
| 3.1 Bt菌株的分离与形态 | 第37-38页 |
| 3.2 标准菌株基因组提取 | 第38页 |
| 3.3 新基因的克隆及序列分析 | 第38-44页 |
| 3.3.1 菌株cry2基因型的鉴定 | 第38-39页 |
| 3.3.2 cry2基因PCR鉴定及重组质粒测序 | 第39-40页 |
| 3.3.3 cry2基因在大肠杆菌中的表达 | 第40-41页 |
| 3.3.4 Cry2蛋白三级结构的分析 | 第41-43页 |
| 3.3.5 cry4基因的克隆及序列分析 | 第43页 |
| 3.3.6 cry4基因在大肠杆菌中的表达 | 第43-44页 |
| 3.3.7 Cry4蛋白结构分析 | 第44页 |
| 3.4 Bt菌株的总蛋白表达 | 第44-45页 |
| 3.5 生物活性测定 | 第45-48页 |
| 3.5.1 初筛 | 第45-47页 |
| 3.5.2 复筛 | 第47-48页 |
| 4 讨论 | 第48-50页 |
| 5 结论 | 第50-51页 |
| 致谢 | 第51-52页 |
| 参考文献 | 第52-62页 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 | 第62页 |
