| 摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8-9页 |
| 第一章 文献综述 | 第14-31页 |
| 1.1 基因组靶向修饰 | 第14-16页 |
| 1.2 FokI介导的核酸酶技术 | 第16-18页 |
| 1.2.1 锌指核酸酶技术 | 第16-17页 |
| 1.2.2 TALE核酸酶技术 | 第17-18页 |
| 1.3 CRISPR/Cas9核酸酶技术 | 第18-29页 |
| 1.3.1 细菌CRISPR/Cas免疫系统 | 第19-21页 |
| 1.3.2 CRISPR/Cas9核酸酶技术的体外研究 | 第21-22页 |
| 1.3.3 CRISPR/Cas9核酸酶技术的迅速崛起 | 第22-24页 |
| 1.3.4 CRISPR/Cas9核酸酶技术的优缺点 | 第24-25页 |
| 1.3.5 CRISPR/Cas9衍生技术的开发 | 第25-28页 |
| 1.3.6 不同来源的CRISPR/Cas平台开发 | 第28-29页 |
| 1.4 本研究的目的意义 | 第29-31页 |
| 第二章 酵母StCRISPR/Cas9系统的建立 | 第31-47页 |
| 2.1 试验材料 | 第31-32页 |
| 2.1.1 菌种与培养基 | 第31页 |
| 2.1.2 主要试剂和仪器 | 第31-32页 |
| 2.1.3 引物序列 | 第32页 |
| 2.2 试验方法 | 第32-39页 |
| 2.2.1 bStCas9基因克隆和酵母表达载体构建 | 第32-33页 |
| 2.2.2 StCas9蛋白在酵母中的表达检测 | 第33页 |
| 2.2.3 导向RNA酵母表达载体构建 | 第33-34页 |
| 2.2.4 导向RNA分子的设计 | 第34-35页 |
| 2.2.5 基于Gal4的酵母报告载体构建 | 第35-37页 |
| 2.2.6 Gal4报告载体自修复效率检测试验 | 第37页 |
| 2.2.7 StCRISPR/Cas9系统活性验证酵母转化试验 | 第37-38页 |
| 2.2.8 Gal4报告基因的修复检测 | 第38-39页 |
| 2.3 试验结果 | 第39-44页 |
| 2.3.1 bStCas9基因的克隆及表达 | 第39-40页 |
| 2.3.2 Gal4报告载体自修复效率检测结果 | 第40页 |
| 2.3.3 StCRISPR/Cas9系统在酵母中的活性验证 | 第40-42页 |
| 2.3.4 Gal4报告基因的修复检测 | 第42-44页 |
| 2.4 讨论 | 第44-45页 |
| 2.5 本章小结 | 第45-47页 |
| 第三章 酵母中StCRISPR/Cas9系统的优化 | 第47-64页 |
| 3.1 材料与方法 | 第47-52页 |
| 3.1.1 试验材料 | 第47页 |
| 3.1.2 酵母转化试验 | 第47页 |
| 3.1.3 sgRNA不同结构域的优化 | 第47-48页 |
| 3.1.4 StCRISPR/Cas9脱靶效应研究 | 第48-49页 |
| 3.1.5 StCRISPR/Cas9靶序列偏好性研究 | 第49-50页 |
| 3.1.6 PAM序列的研究 | 第50页 |
| 3.1.7 sgRNA的优化设计和功能验证 | 第50-51页 |
| 3.1.8 StCas9密码子优化和功能验证 | 第51-52页 |
| 3.2 试验结果 | 第52-60页 |
| 3.2.1 sgRNA不同结构域的优化结果 | 第52-56页 |
| 3.2.2 StCRISPR/Cas9脱靶效应研究结果 | 第56-57页 |
| 3.2.3 StCRISPR/Cas9靶序列偏好性研究结果 | 第57-58页 |
| 3.2.4 PAM序列的研究结果 | 第58-59页 |
| 3.2.5 优化后sgRNA的功能验证 | 第59-60页 |
| 3.3 讨论 | 第60-62页 |
| 3.4 本章小结 | 第62-64页 |
| 第四章 StCRISPR/Cas9系统酵母基因组打靶验证 | 第64-71页 |
| 4.1 材料与方法 | 第64-66页 |
| 4.1.1 试验材料 | 第64页 |
| 4.1.2 整合型Gal4报告载体构建 | 第64-65页 |
| 4.1.3 酵母报告菌株构建 | 第65页 |
| 4.1.4 酵母报告菌株转化试验 | 第65-66页 |
| 4.1.5 基因组中Gal4基因的修复检测 | 第66页 |
| 4.2 试验结果 | 第66-69页 |
| 4.2.1 酵母报告菌株的构建和鉴定 | 第66-67页 |
| 4.2.2 不同SSA同源臂长度的报告菌株比较 | 第67页 |
| 4.2.3 基因组中Gal4基因修复的检测结果 | 第67-68页 |
| 4.2.4 StCRISPR/Cas9酵母基因组水平的打靶验证 | 第68-69页 |
| 4.3 讨论 | 第69-70页 |
| 4.4 本章小结 | 第70-71页 |
| 第五章 哺乳动物StCRISPR/Cas9系统的建立 | 第71-85页 |
| 5.1 试验材料 | 第72-73页 |
| 5.1.1 细胞系与培养基 | 第72页 |
| 5.1.2 主要试剂和仪器 | 第72页 |
| 5.1.3 引物序列 | 第72-73页 |
| 5.2 试验方法 | 第73-78页 |
| 5.2.1 StCas9哺乳动物表达载体构建 | 第73页 |
| 5.2.2 不同策略的导向RNA表达载体构建 | 第73-75页 |
| 5.2.3 SSA介导的eGFP报告载体构建 | 第75-77页 |
| 5.2.4 细胞转染试验 | 第77-78页 |
| 5.2.5 流式细胞术检测与分析 | 第78页 |
| 5.3 试验结果 | 第78-82页 |
| 5.3.1 哺乳动物StCRISPR/Cas9活性验证系统的建立 | 第78-80页 |
| 5.3.2 不同导向RNA表达策略的比较 | 第80-81页 |
| 5.3.3 优化后sgRNA.Opti在HEK293中的活性验证 | 第81-82页 |
| 5.3.4 StCRISPR/Cas9对鼠ROSA26靶序列的打靶验证 | 第82页 |
| 5.4 讨论 | 第82-84页 |
| 5.5 本章小结 | 第84-85页 |
| 第六章 StCRISPR/Cas9系统HEK293T细胞基因组打靶研究 | 第85-96页 |
| 6.1 材料与方法 | 第86-88页 |
| 6.1.1 试验材料 | 第86页 |
| 6.1.2 整合型eGFP报告载体构建 | 第86页 |
| 6.1.3 HEK293T报告细胞系构建 | 第86页 |
| 6.1.4 HEK293T报告细胞系转染试验 | 第86页 |
| 6.1.5 报告细胞系中的基因组打靶检测 | 第86-87页 |
| 6.1.6 HEK293T内源基因打靶载体构建及活性验证 | 第87页 |
| 6.1.7 RPG双报告基因载体构建 | 第87-88页 |
| 6.1.8 HEK293T内源基因打靶及突变检测 | 第88页 |
| 6.2 试验结果 | 第88-92页 |
| 6.2.1 HEK293报告细胞系基因组打靶验证结果 | 第88-89页 |
| 6.2.2 HEK293T内源基因打靶载体活性验证结果 | 第89-90页 |
| 6.2.3 核酸酶阳性细胞的RPG富集 | 第90-92页 |
| 6.2.4 HEK293T内源基因的突变检测结果 | 第92页 |
| 6.3 讨论 | 第92-94页 |
| 6.4 本章小结 | 第94-96页 |
| 结论与创新点 | 第96-99页 |
| 参考文献 | 第99-109页 |
| 附录 | 第109-124页 |
| 缩略 词 | 第124-125页 |
| 致谢 | 第125-126页 |
| 作者简介 | 第126-128页 |
