| 摘要 | 第1-6页 |
| ABSTRACT | 第6-8页 |
| 符号说明 | 第8-15页 |
| 第一部分 文献综述 | 第15-27页 |
| ·RNA编辑的研究进展 | 第15-19页 |
| ·RNA编辑的类型 | 第15-16页 |
| ·锥体虫线粒体基因U的插入和去除 | 第16-17页 |
| ·高等生物A到I的RNA编辑 | 第17-18页 |
| ·高等生物C到U的RNA编辑 | 第18-19页 |
| ·载脂蛋白B(ApoB)的研究进展 | 第19-23页 |
| ·ApoB-100与ApoB-48在脂类中的代谢 | 第19-20页 |
| ·ApoB-100 RNA的编辑序列 | 第20-21页 |
| ·参与ApoB RNA编辑的相关酶 | 第21-22页 |
| ·ApoB RNA编辑的调节机制 | 第22页 |
| ·ApoB RNA编辑与疾病治疗 | 第22-23页 |
| ·CDKs与细胞周期调控 | 第23-24页 |
| ·RNAi技术 | 第24-27页 |
| 第二部分 ApoB RNA编辑的慢病毒表达载体构建及其稳定株的筛选 | 第27-39页 |
| ·实验材料 | 第27-29页 |
| ·质粒菌株及细胞株 | 第27页 |
| ·主要试剂 | 第27-28页 |
| ·主要实验仪器、设备 | 第28页 |
| ·要试剂的配置 | 第28-29页 |
| ·实验方法 | 第29-35页 |
| ·慢病毒表达载体pCSⅡ-DsRed-CAA-GFP-Neo~r的构建 | 第29-32页 |
| ·感受态E.coli DH5 α的制备 | 第29-30页 |
| ·质粒转化 | 第30页 |
| ·质粒小量抽提 | 第30页 |
| ·NheI、BamHI双酶切质粒 | 第30-31页 |
| ·酶切产物的割胶回收 | 第31页 |
| ·基因片段和载体片段的连接 | 第31-32页 |
| ·连接产物的转化 | 第32页 |
| ·质粒小量抽提 | 第32页 |
| ·NheI、BamHI双酶切鉴定重组产物 | 第32页 |
| ·质粒的大量制备 | 第32页 |
| ·重组慢病毒的制备 | 第32-34页 |
| ·HEK-293FT细胞培养 | 第32-33页 |
| ·慢病毒的包装 | 第33页 |
| ·病毒的收集与浓缩 | 第33-34页 |
| ·病毒滴度的测定 | 第34页 |
| ·Caco-2、CBRH-7919稳定株的建立 | 第34-35页 |
| ·Caco-2、CBRH-7919细胞培养 | 第34页 |
| ·G418最优浓度的筛选 | 第34-35页 |
| ·慢病毒感染细胞 | 第35页 |
| ·Caco-2、CBRH-7919稳定细胞系的筛选 | 第35页 |
| ·实验结果 | 第35-36页 |
| ·重组质粒pCSⅡ-DsRed-CAA-GFP-Neo~r酶切鉴定结果 | 第35-36页 |
| ·Caco-2、CBRH-7919细胞株G418最优浓度的筛选结果 | 第36页 |
| ·Caco-2、CBRH-7919稳定株筛选结果 | 第36页 |
| ·讨论 | 第36-37页 |
| ·小结 | 第37-39页 |
| 第三部分 携带CDK1/CDK2-shRNA重组慢病毒载体的构建及功能鉴定 | 第39-57页 |
| ·实验材料 | 第39-40页 |
| ·质粒菌株及细胞株 | 第39页 |
| ·主要试剂 | 第39-40页 |
| ·主要试剂的配置 | 第40页 |
| ·实验方法 | 第40-50页 |
| ·慢病毒干扰载体pLK0.1-shRNA-puro的构建 | 第40-44页 |
| ·质粒转化 | 第40-41页 |
| ·质粒小量抽提 | 第41页 |
| ·AgeI、EcoRI双酶切质粒pLK0.1-puro | 第41页 |
| ·酶切产物的割胶回收 | 第41-42页 |
| ·siRNA序列的选择和合成 | 第42页 |
| ·siRNA序列退火形成双链 | 第42-43页 |
| ·siRNA双链和载体片段的连接及转化 | 第43页 |
| ·质粒的小量抽提及鉴定 | 第43-44页 |
| ·慢病毒的制备 | 第44页 |
| ·RNAi质粒的大量制备 | 第44页 |
| ·慢病毒的包装 | 第44页 |
| ·病毒的收集与浓缩 | 第44页 |
| ·慢病毒感染Caco-2、CBRH-7919细胞株 | 第44页 |
| ·特异性的RNAi慢病毒载体的干扰功能鉴定 | 第44-50页 |
| ·实时荧光qRT-PCR检测CDK1、CDK2 mRNA表达 | 第45-48页 |
| ·Western Blot检测CDK1、CDK2蛋白的表达 | 第48-50页 |
| ·统计学分析 | 第50页 |
| ·实验结果 | 第50-55页 |
| ·重组质粒pLK0.1-shRNA-puro的测序结果 | 第50-51页 |
| ·Real-Time PCR CDK1、CDK2 mRNA表达的检测结果 | 第51-54页 |
| ·RNA完整性鉴定结果 | 第51-52页 |
| ·荧光实时定量PCR检测结果 | 第52-54页 |
| ·Western Blot检测CDK1、CDK2蛋白表达的结果 | 第54-55页 |
| ·讨论 | 第55-56页 |
| ·小结 | 第56-57页 |
| 第四部分 CDK1与CDK2干扰对ApoB RNA编辑的影响 | 第57-71页 |
| ·实验材料 | 第57页 |
| ·细胞株 | 第57页 |
| ·实验病毒 | 第57页 |
| ·主要试剂 | 第57页 |
| ·实验方法 | 第57-64页 |
| ·重组慢病毒感染稳定株细胞 | 第57-58页 |
| ·共聚焦显微镜(LSCM)观察ApoB RNA编辑 | 第58页 |
| ·样品准备 | 第58页 |
| ·LSCM观察 | 第58页 |
| ·流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)检测细胞周期分布 | 第58-59页 |
| ·样品准备 | 第58-59页 |
| ·碘化丙啶(PI)染色 | 第59页 |
| ·FCM上样检测 | 第59页 |
| ·FCM检测ApoB RNA的编辑效率 | 第59页 |
| ·测序法检测ApoB RNA的编辑效率 | 第59-64页 |
| ·样品准备 | 第60页 |
| ·总RNA的提取与纯化 | 第60页 |
| ·cDNA的合成 | 第60页 |
| ·含编辑位点序列的PCR合成 | 第60-61页 |
| ·含多个编辑位点序列载体的构建 | 第61-64页 |
| ·实验结果 | 第64-68页 |
| ·LSCM观察CDK1与CDK2干扰对ApoB RNA编辑的影响 | 第64-65页 |
| ·CDK1与CDK2干扰对细胞周期的影响 | 第65-66页 |
| ·FCM分析CDK1与CDK2干扰对ApoB RNA编辑的影响 | 第66-67页 |
| ·测序法分析CDK干扰对RNA编辑的影响 | 第67-68页 |
| ·讨论 | 第68-70页 |
| ·小结 | 第70-71页 |
| 第五部分 结论 | 第71-72页 |
| 参考文献 | 第72-79页 |
| 致谢 | 第79-81页 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 | 第81-85页 |
