| 摘要 | 第1-12页 |
| Abstract | 第12-14页 |
| 第一章 文献综述 | 第14-33页 |
| 引言 | 第14页 |
| 1. 副溶血弧菌分子生物学研究 | 第14-21页 |
| ·副溶血弧菌概况 | 第14-15页 |
| ·副溶血弧菌的血清型 | 第15页 |
| ·副溶血弧菌引起的疾病 | 第15-16页 |
| ·副溶血弧菌致病性细胞因子 | 第16-17页 |
| ·毒力因子 | 第17-18页 |
| ·副溶血弧菌三型分泌系统（TTSS） | 第18-21页 |
| 2. 基因工程抗体 | 第21-28页 |
| ·基因工程抗体的分类 | 第21-22页 |
| ·基因工程单链抗体(scFv) | 第22-26页 |
| ·单链抗体的应用前景 | 第26-28页 |
| 3. 基因工程单链抗体的可溶性表达 | 第28-33页 |
| ·表达宿主 | 第28页 |
| ·表达条件优化 | 第28-29页 |
| ·融合表达 | 第29-30页 |
| ·蛋白共表达 | 第30-31页 |
| ·蛋白体外复性及冷休克表达 | 第31-33页 |
| 第二章 不耐热溶血素（TLH）的原核表达与纯化 | 第33-46页 |
| 引言 | 第33页 |
| 材料与方法 | 第33-46页 |
| 1. 材料 | 第33页 |
| ·菌株与质粒 | 第33页 |
| ·试剂与耗材 | 第33页 |
| 2. 方法 | 第33-38页 |
| ·引物设计 | 第33-34页 |
| ·质粒提取 | 第34页 |
| ·PCR 扩增 | 第34-35页 |
| ·PCR 产物回收，酶切与连接 | 第35页 |
| ·重组质粒的转化 | 第35-36页 |
| ·重组表达载体的鉴定 | 第36页 |
| ·重组蛋白的诱导表达 | 第36页 |
| ·SDS-PAGE 凝胶电泳 | 第36页 |
| ·重组蛋白的纯化（含 His6 tag 标签） | 第36-37页 |
| ·无 His6 tag 标签 TLH 的化学渗透纯化 | 第37页 |
| ·蛋白浓度测定 | 第37-38页 |
| 3. 结果与分析 | 第38-44页 |
| ·原核表达载体的构建 | 第38页 |
| ·基因 PCR 扩增 | 第38-39页 |
| ·重组载体的鉴定 | 第39页 |
| ·融合蛋白的表达与纯化 | 第39-44页 |
| 4. 讨论 | 第44-45页 |
| ·His tag 标签的合成 | 第44页 |
| ·原核表达载体的构建 | 第44页 |
| ·蛋白表达与纯化 | 第44-45页 |
| 5. 小结 | 第45-46页 |
| 第三章 TLH 细胞毒性效应测定及抗血清的制备 | 第46-55页 |
| 引言 | 第46页 |
| 材料与方法 | 第46-55页 |
| 1. 材料 | 第46页 |
| ·实验材料和试剂 | 第46页 |
| 2. 方法 | 第46-49页 |
| ·蛋白透析与浓缩 | 第46页 |
| ·蛋白浓度测定 | 第46页 |
| ·细胞培养 | 第46-47页 |
| ·TLH 毒素预处理 | 第47页 |
| ·MTT 测定 | 第47页 |
| ·Balb/c 小鼠免疫 | 第47页 |
| ·抗血清效价 ELISA 测定 | 第47-49页 |
| 3. 结果与分析 | 第49-54页 |
| ·蛋白透析与浓缩 | 第49页 |
| ·TLH 处理细胞形态变化 | 第49页 |
| ·细胞存活力测定 | 第49-50页 |
| ·TLH 细胞毒性测定 | 第50页 |
| ·TLH 抗血清 ELISA 测定 | 第50-54页 |
| 4. 讨论 | 第54页 |
| ·蛋白透析与浓缩 | 第54页 |
| ·细胞培养 | 第54页 |
| ·动物免疫与效价测定 | 第54页 |
| 5. 小结 | 第54-55页 |
| 第四章 抗 TLH 噬菌体抗体库的构建与淘选 | 第55-67页 |
| 引言 | 第55页 |
| 材料与方法 | 第55-67页 |
| 1. 材料 | 第55页 |
| 2. 方法 | 第55-59页 |
| ·脾脏总 RNA 的提取 | 第55页 |
| ·RNA 反转录 | 第55-56页 |
| ·抗体 VH和 VL基因的 PCR 扩增 | 第56页 |
| ·scFv PCR 扩增 | 第56-57页 |
| ·重组载体的构建 | 第57页 |
| ·噬菌体抗体库的制备 | 第57页 |
| ·抗 TLH 单链抗体的淘选 | 第57-58页 |
| ·TLH 抗原特异性单链抗体的 ELISA 检测 | 第58-59页 |
| 3. 结果与分析 | 第59-65页 |
| ·脾脏总 RNA 的提取 | 第59页 |
| ·PCR 扩增 VH，VL和 Linker DNA | 第59-60页 |
| ·scFv PCR 扩增 | 第60-61页 |
| ·噬菌体抗体库库容量测定 | 第61页 |
| ·噬菌体抗体库的淘选 | 第61-63页 |
| ·特异性单链抗体的 ELISA 检测 | 第63-65页 |
| 4. 讨论 | 第65-66页 |
| ·脾脏总 RNA 的提取 | 第65页 |
| ·PCR 扩增 | 第65页 |
| ·噬菌体抗体库的构建 | 第65-66页 |
| ·噬菌体抗体库的淘选和富集 | 第66页 |
| 5. 小结 | 第66-67页 |
| 第五章 基因工程单链抗体的分子鉴定 | 第67-84页 |
| 引言 | 第67页 |
| 材料与方法 | 第67-84页 |
| 1. 实验材料 | 第67页 |
| 2. 方法 | 第67-71页 |
| ·重组噬菌体质粒 DNA 提取 | 第67页 |
| ·PCR 验证转化子 | 第67-68页 |
| ·酶切验证 | 第68页 |
| ·DNA 测序分析 | 第68页 |
| ·scFv 基因序列生物学信息学分析 | 第68页 |
| ·单链抗体的可溶性表达 | 第68-69页 |
| ·单链抗体分子的特异性鉴定 | 第69-70页 |
| ·LA3-scFv 亲和力测定 | 第70-71页 |
| 3. 结果与分析 | 第71-82页 |
| ·PCR 扩增 scFv 基因 | 第71页 |
| ·重组载体的酶切验证 | 第71-72页 |
| ·scFv 序列分析 | 第72-73页 |
| ·scFv IMGT 分析 | 第73-77页 |
| ·LA3-scFv ExPASy 分析 | 第77-78页 |
| ·scFv 可溶性表达与 ELISA 检测 | 第78-79页 |
| ·Western Blotting | 第79-80页 |
| ·LA3-scFv 抗体特异性检测 | 第80-81页 |
| ·LA3-scFv 亲和力测定 | 第81-82页 |
| 4. 讨论 | 第82-83页 |
| ·scFv 基因序列分析 | 第82页 |
| ·单链抗体的可溶性表达 | 第82-83页 |
| ·可溶性表达蛋白的分子鉴定 | 第83页 |
| 5. 小结 | 第83-84页 |
| 第六章 单链抗体 LA3-scFv 的功能分析 | 第84-91页 |
| 引言 | 第84页 |
| 材料与方法 | 第84-91页 |
| 1. 材料 | 第84页 |
| 2. 方法 | 第84-87页 |
| ·蛋白透析与浓缩 | 第84页 |
| ·蛋白浓度测定 | 第84-85页 |
| ·噬菌体单链抗体的制备 | 第85页 |
| ·细胞培养 | 第85页 |
| ·TLH 毒素预处理 | 第85页 |
| ·单链抗体中和反应 | 第85-86页 |
| ·MTT 测定 | 第86页 |
| ·细胞流式测定 | 第86-87页 |
| 3. 结果与分析 | 第87-90页 |
| ·LA3-scFv 中和效应 MTT 测定 | 第87-89页 |
| ·LA3-scFv 中和效应细胞流式（FACS）测定 | 第89-90页 |
| 4. 讨论 | 第90页 |
| ·单链抗体 scFv 中和 TLH 毒性效应 | 第90页 |
| 5. 小结 | 第90-91页 |
| 第七章 基因工程单链抗体的体外可溶性表达与鉴定 | 第91-114页 |
| 引言 | 第91页 |
| 材料与方法 | 第91-114页 |
| 1. 材料 | 第91-92页 |
| ·菌株与质粒 | 第91-92页 |
| ·试剂与耗材 | 第92页 |
| 2. 方法 | 第92-98页 |
| ·引物设计 | 第92-93页 |
| ·质粒提取和基因组 DNA 提取 | 第93页 |
| ·PCR 扩增 | 第93-94页 |
| ·PCR 产物回收，酶切与连接 | 第94页 |
| ·重组质粒的转化 | 第94页 |
| ·重组表达载体的鉴定 | 第94页 |
| ·重组蛋白的诱导表达 | 第94页 |
| ·SDS-PAGE 凝胶电泳 | 第94页 |
| ·重组蛋白的纯化 | 第94-95页 |
| ·蛋白浓度测定 | 第95页 |
| ·Western Blotting 鉴定纯化的 scFv | 第95-96页 |
| ·4 种不同表达形式蛋白的 ELISA 测定 | 第96页 |
| ·ELISA 测定 scFv 特异性 | 第96页 |
| ·Western Blotting 验证抗原抗体反应 | 第96-97页 |
| ·SPR 测定抗体亲和力 | 第97-98页 |
| 3. 结果与分析 | 第98-112页 |
| ·原核表达载体的构建 | 第98-99页 |
| ·PCR 扩增 | 第99-100页 |
| ·重组载体的酶切验证 | 第100-101页 |
| ·重组载体的 DNA 测序 | 第101-102页 |
| ·重组蛋白的诱导表达 | 第102-103页 |
| ·蛋白可溶性表达测定 | 第103-107页 |
| ·scFv 蛋白纯化与 Western Blotting 分析 | 第107-108页 |
| ·scFv 纯化蛋白的 ELISA 检测 | 第108页 |
| ·Skp 共表达 scFv 特异性鉴定 | 第108-110页 |
| ·亲和力测定 | 第110-112页 |
| 4. 讨论 | 第112-113页 |
| ·表达载体的构建 | 第112页 |
| ·蛋白可溶性表达 | 第112-113页 |
| ·scFv 蛋白的鉴定 | 第113页 |
| 5. 小结 | 第113-114页 |
| 总结与展望 | 第114-117页 |
| 总结 | 第114-116页 |
| 1. TLH 抗原表达与纯化 | 第114页 |
| 2. 细胞毒性效应测定与动物免疫 | 第114-115页 |
| 3. 噬菌体抗体库的构建与淘选 | 第115页 |
| 4. 噬菌体单链抗体的鉴定 | 第115页 |
| 5. 噬菌体单链抗体能够中和 TLH 诱导的细胞毒性效应 | 第115页 |
| 6. scFv 蛋白体外可溶性表达 | 第115-116页 |
| 展望 | 第116-117页 |
| 参考文献 | 第117-132页 |
| 致谢 | 第132-133页 |
| 附录 1 | 第133页 |
| 在读期间发表论文情况 | 第133页 |
