沉默Smurfl对结肠癌细胞系生物学行为的影响

【摘要】：目的1、构建Smurfl shRNA真核表达载体。2、分析沉默Smurf1对结肠癌细胞系增殖、迁移、侵袭和EMT转化的影响。方法1.Smurf1 shRNA载体的构建 用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ将pSilencer4.1质粒和Smurf1同时进行双酶切后,T4 DNA ligase连接；测序验证。2 Smurf1 shRNA转染结肠癌细胞系 将脂质体和干扰质粒同时转染入复苏好的结肠癌细胞中。3. Smurf1 shRNA稳转细胞系的筛选 确定筛选稳转细胞系的G418浓度,并筛选出Smurf1 shRNA稳转细胞系。4. Western blot验证转染是否成功 检测S murf1蛋白表达,确定转染效果。5. MTT分析shRNA对结肠癌细胞增殖的影响 MTT法检测结肠癌细胞增殖情况。6. Smurf1 shRNA对结肠癌细胞迁移的影响划痕实验检测结肠癌细胞迁移情况。7 Smurf1 shRNA对结肠癌细胞侵袭的影响Transwell实验检测结肠癌细胞侵袭情况。8下调Smurf1对结肠癌细胞EMT转化的影响Western blot检测E-cadherin蛋白和Vimentin蛋白的表达水平降低反映结肠癌细胞EMT转化情况。结果1、Smurf1 shRNA重组质粒构建成功。2、与对照组相比,转染有干扰载体的结肠癌细胞系HCT116和SW480随着时间的增加细胞的增殖速率降低。3、转染shRNA重组质粒的结肠癌细胞迁移能力下降。4、Transwell实验证明转染干扰载体后,结肠癌细胞穿越滤膜的细胞数目降低。5、结肠癌细胞中的Smurf1表达下调,增加了E-cadherin的表达水平,降低了Vimentin和Twist的表达水平。结论1、成功的构建了Smurf1干扰载体,该载体能够抑制Smurf1的表达。2、结肠癌细胞中Smurf1表达下降,抑制了细胞的增殖、迁移和侵袭能力。
【关键词】：Smurf1 RNA干扰 结肠癌 EMT BMP信号通路
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R735.35