| 本文创新性工作 | 第1-5页 |
| 中文摘要 | 第5-8页 |
| Abstract | 第8-12页 |
| 常用英文缩略词汇 | 第12-19页 |
| 第一部分 文献综述 | 第19-47页 |
| 第一章 牛病毒性腹泻病毒研究 | 第19-47页 |
| 1. 病原学 | 第19-21页 |
| 2. BVDV流行病学 | 第21-25页 |
| ·传染源 | 第21页 |
| ·传播途径 | 第21-22页 |
| ·易感动物 | 第22页 |
| ·流行特点 | 第22页 |
| ·国外BVDV流行状况 | 第22页 |
| ·国内BVDV流行状况 | 第22-25页 |
| 3. BVD临床表现及致病机理 | 第25-30页 |
| ·病毒性腹泻 | 第26页 |
| ·急性BVD | 第26-27页 |
| ·黏膜病(MD) | 第27-28页 |
| ·繁殖障碍 | 第28页 |
| ·持续性感染(PI)与免疫耐受 | 第28-29页 |
| ·血小板减少症与出血综合症 | 第29-30页 |
| ·免疫抑制 | 第30页 |
| 4. BVDV检测方法 | 第30-36页 |
| ·病毒分离鉴定 | 第30页 |
| ·电镜观察 | 第30-31页 |
| ·微量血清中和试验 | 第31页 |
| ·酶联免疫吸附试验 | 第31-32页 |
| ·免疫荧光技术与免疫过氧化物酶技术 | 第32-33页 |
| ·分子生物学检测技术 | 第33-36页 |
| ·反转录-多聚链式反应(RT-PCR) | 第33-34页 |
| ·荧光定量PCR技术(FIuorescent Quantitative PCR,FQ-PCR) | 第34-35页 |
| ·核酸杂交(NAH)技术 | 第35-36页 |
| 5. BVDV分子生物学特征 | 第36-42页 |
| ·BVDV基因组结构 | 第36-38页 |
| ·5'-UTR | 第36-37页 |
| ·3'-UTR | 第37页 |
| ·开放阅读框架(ORF) | 第37-38页 |
| ·BVDV的结构蛋白 | 第38-40页 |
| ·衣壳蛋白C | 第38页 |
| ·囊膜蛋白gp48 | 第38-39页 |
| ·囊膜蛋白gp25 | 第39页 |
| ·囊膜蛋白gp53 | 第39-40页 |
| ·BVDV的非结构蛋白 | 第40-42页 |
| ·Npro(P20)蛋白 | 第40页 |
| ·P7 | 第40-41页 |
| ·NS2-3 (P125、NS2与NS3 | 第41页 |
| ·NS4A(P10)与NS4B(P30) | 第41页 |
| ·NS5A (P58) | 第41-42页 |
| ·NS5B (P75) | 第42页 |
| 6. 猪源牛病毒性腹泻病毒(pig BVDV)研究进展 | 第42-45页 |
| ·猪源BVDV流行病学 | 第42-44页 |
| ·猪源BVDV致病性 | 第44-45页 |
| ·猪源BVDV诊断 | 第45页 |
| ·结语 | 第45页 |
| 7. 研究目的与意义 | 第45-47页 |
| 第二部分 试验研究 | 第47-149页 |
| 第二章 猪源牛病毒性腹泻病毒分离与鉴定 | 第47-59页 |
| 摘要 | 第47-48页 |
| 1. 材料与方法 | 第48-52页 |
| ·病料来源与处理 | 第48-49页 |
| ·细胞、标准毒株和主要试剂 | 第49页 |
| ·样品BVDV 5'-UTR检测 | 第49页 |
| ·病毒分离 | 第49页 |
| ·病毒鉴定 | 第49-52页 |
| ·进化关系分析 | 第49-51页 |
| ·抗原性检测(直接免疫荧光法) | 第51-52页 |
| ·病毒的电镜观察 | 第52页 |
| ·病毒TCID_(50)测定 | 第52页 |
| 2. 结果 | 第52-57页 |
| ·样品RT-PCR检测 | 第52-53页 |
| ·生物型鉴定 | 第53页 |
| ·抗原性检测(直接免疫荧光法) | 第53-54页 |
| ·电镜观察 | 第54页 |
| ·TCID50测定结果 | 第54页 |
| ·进化关系分析 | 第54-57页 |
| 3. 讨论 | 第57-58页 |
| Abstract | 第58-59页 |
| 第三章 猪源牛病毒性腹泻病毒SD0803株全长基因序列的测定及生物信息学分析 | 第59-92页 |
| 摘要 | 第59-61页 |
| 1. 材料 | 第61-62页 |
| ·毒株、菌株、细胞株等主要试剂 | 第61页 |
| ·主要仪器 | 第61页 |
| ·主要试剂配制 | 第61页 |
| ·BVDVs参考毒株全基因序列 | 第61-62页 |
| ·生物信息学软件 | 第62页 |
| 2. 方法 | 第62-73页 |
| ·病毒增殖 | 第62-63页 |
| ·病毒浓缩 | 第63页 |
| ·病毒RNA的提取 | 第63-64页 |
| ·引物设计及合成 | 第64-65页 |
| ·反转录cDNA合成 | 第65页 |
| ·全基因RT-PCR扩增 | 第65-66页 |
| ·RT-PCR反应体系 | 第65页 |
| ·RT-PCR反应条件 | 第65-66页 |
| ·PCR产物的纯化 | 第66页 |
| ·DNA片段与克隆载体的连接 | 第66页 |
| ·连接产物的转化 | 第66页 |
| ·重组质粒的抽提及测序 | 第66页 |
| ·病毒5’-RACE扩增 | 第66-70页 |
| ·提取的病毒RNA琼脂糖凝胶电泳鉴定 | 第67页 |
| ·第一链cDNA合成 | 第67-68页 |
| ·5'-RACE PCR快速扩增 | 第68页 |
| ·套式PCR扩增产物回收 | 第68-69页 |
| ·DNA片段与克隆载体的连接 | 第69页 |
| ·连接产物的转化 | 第69页 |
| ·重组质粒的抽提及测序 | 第69-70页 |
| ·病毒3’-RACE扩增 | 第70-72页 |
| ·病毒RNA提取及RNA浓度测定 | 第70页 |
| ·全基因组RNA 3'末端加Poly(A)“尾”标记 | 第70页 |
| ·病毒3'-RACE cDNA合成 | 第70-71页 |
| ·病毒3'-RACE PCR快速扩增 | 第71-72页 |
| ·Touchdown PCR扩增产物回收 | 第72页 |
| ·DNA片段与克隆载体的迩接 | 第72页 |
| ·连接产物的转化 | 第72页 |
| ·重组质粒的抽提及测序 | 第72页 |
| ·全基因序列拼接 | 第72页 |
| ·SD0803与瘟病毒参考株同源性分析 | 第72-73页 |
| ·SD0803分离株全基因核苷酸序列进化关系分析 | 第73页 |
| ·非编码区一级、二级结构分析 | 第73页 |
| ·结构蛋白(E0、E1、E2)糖基化位点分析 | 第73页 |
| ·SD0803株RdRp蛋白质高级结构预测 | 第73页 |
| 3. 结果 | 第73-88页 |
| ·病毒基因RT-PCR扩增 | 第73-75页 |
| · | 第75页 |
| ·病毒5'-RACE与3'-RACE PCR扩增结果 | 第75页 |
| ·SD0803全基因序列拼接结果 | 第75-76页 |
| ·SD0803分离株各基因与瘟病毒参考株核苷酸序列分析 | 第76-77页 |
| ·SD0803株与其他瘟病毒参考株进化关系分析 | 第77-78页 |
| ·5'-UTR进化关系分析 | 第77页 |
| ·Npro进化关系分析 | 第77页 |
| ·全基因序列进化关系分析 | 第77-78页 |
| ·SD0803株非编码区RNA一级结构与二级结构分析 | 第78-83页 |
| ·SD0803株5'-UTR RNA一级结构特征分析 | 第78-80页 |
| ·SD0803株5'-UTR RNA二级结构分析 | 第80-81页 |
| ·3'-UTR RNA一级结构与二级结构分析 | 第81-83页 |
| ·结构蛋白序列及糖基化位点分析 | 第83-85页 |
| ·I-TASSER对SD0803株RdRp蛋白质二级结构预测 | 第85页 |
| ·I-TASSER对SD0803株RdRp三级结构的预测 | 第85-86页 |
| ·SD0803株RdRp功能的预测 | 第86-88页 |
| ·EC的预测 | 第86-87页 |
| ·结合位点(Binding Site)的预测 | 第87-88页 |
| 4. 讨论 | 第88-90页 |
| Abstract | 第90-92页 |
| 第四章 猪源牛病毒性腹泻病毒套式PCR检测方法的建立 | 第92-105页 |
| 摘要 | 第92-93页 |
| 1. 材料与方法 | 第93-100页 |
| ·病毒株、细胞株 | 第93页 |
| ·样品来源 | 第93-94页 |
| ·主要试剂(盒) | 第94页 |
| ·主要试剂配制 | 第94-95页 |
| ·主要仪器 | 第95页 |
| ·引物设计合成 | 第95-96页 |
| ·病毒增殖、浓缩 | 第96页 |
| ·病毒RNA提取与cDNA合成 | 第96-97页 |
| ·PCR扩增及鉴定 | 第97-98页 |
| ·第一轮PCR(RT-PCR) | 第97页 |
| ·Nested-PCR | 第97-98页 |
| ·PCR产物纯化 | 第98页 |
| ·纯化PCR产物连接与转化 | 第98-99页 |
| ·重组质粒的抽提 | 第99页 |
| ·重组质粒的鉴定 | 第99页 |
| ·Nested-PCR特异性试验 | 第99-100页 |
| ·Nested-PCR敏感性试验 | 第100页 |
| ·Nested-PCR重复性试验 | 第100页 |
| ·Nested-PCR临床应用检测 | 第100页 |
| 2. 结果 | 第100-103页 |
| ·Nested-PCR扩增及鉴定 | 第100-101页 |
| ·Nested-PCR特异性试验结果 | 第101-102页 |
| ·Nested-PCR敏感性试验 | 第102页 |
| ·Nested-PCR重复性试验 | 第102页 |
| ·Nested-PCR初步应用检测结果 | 第102-103页 |
| 3. 讨论 | 第103-104页 |
| Abstract | 第104-105页 |
| 第五章 我国部分地区猪源牛病毒性腹泻病毒分子流行病学研究 | 第105-132页 |
| 摘要 | 第105-107页 |
| 1. 材料与方法 | 第107-110页 |
| ·样品采集 | 第107-108页 |
| ·主要试剂(盒) | 第108页 |
| ·主要仪器 | 第108页 |
| ·RT-PCR及套式PCR检测方法 | 第108页 |
| ·目的DNA片段的回收 | 第108-109页 |
| ·目的片段与克隆载体的连接 | 第109页 |
| ·连接产物的转化 | 第109页 |
| ·重组质粒的抽提及测序 | 第109页 |
| ·检测结果与临床数据分析 | 第109页 |
| ·序列比对与进化关系分析 | 第109-110页 |
| 2. 结果与分析 | 第110-128页 |
| ·RT-PCR及套式PCR扩增结果 | 第110-112页 |
| ·套式PCR检测样品统计结果 | 第112-113页 |
| ·牛场牛血清5'-UTR序列分析 | 第113-115页 |
| ·商品胎牛血清5'-UTR序列分析 | 第115-117页 |
| ·猪瘟活疫苗5'-UTR序列分析 | 第117-119页 |
| ·猪源BVDV 5'-UTR序列遗传进化分析 | 第119-121页 |
| ·猪源BVDV与牛血清源BVDV分析 | 第121-124页 |
| ·猪源BVDV毒株与猪瘟疫苗源毒株遗传进化分析 | 第124-128页 |
| ·CSFV、PRRSV与PCV2在BVDV混合感染情况 | 第128页 |
| 3. 讨论 | 第128-131页 |
| ·RT-PCR与套式PCR检测 | 第128页 |
| ·猪群中BVDV的感染 | 第128-129页 |
| ·BVDV污染生物制品问题 | 第129页 |
| ·牛血清BVDV遗传进化分析 | 第129-130页 |
| ·猪源BVDV的进化分析 | 第130页 |
| ·猪源BVDV与牛血清、猪瘟疫苗进化分析 | 第130-131页 |
| Abstract | 第131-132页 |
| 第六章 猪源牛病毒性腹泻病毒荧光定量PCR检测方法的建立 | 第132-140页 |
| 摘要 | 第132-133页 |
| 1. 材料与方法 | 第133-136页 |
| ·病毒 | 第133页 |
| ·主要试剂及仪器 | 第133-134页 |
| ·引物及探针设计合成 | 第134页 |
| ·标准阳性标准品模板制备 | 第134-135页 |
| ·猪源BVDV 5'-UTR扩增 | 第134-135页 |
| ·含目的基因重组质粒的构建及浓度测定 | 第135页 |
| ·标准曲线的建立 | 第135页 |
| ·特异性试验 | 第135页 |
| ·敏感性试验 | 第135页 |
| ·重复性试验 | 第135-136页 |
| ·临床应用 | 第136页 |
| 2. 结果与分析 | 第136-138页 |
| ·含猪源BVDV 5'-UTR重组质粒的构建及浓度测定 | 第136页 |
| ·FQ-PCR反应体系的优化 | 第136-137页 |
| ·标准曲线的建立 | 第137页 |
| ·特异性试验 | 第137页 |
| ·敏感性试验 | 第137-138页 |
| ·重复性试验 | 第138页 |
| ·临床应用 | 第138页 |
| 3. 讨论 | 第138-139页 |
| Abstract | 第139-140页 |
| 第七章 猪源牛病毒性腹泻病毒E2蛋白表达及抗体制备 | 第140-149页 |
| 摘要 | 第140-141页 |
| 1. 材料与方法 | 第141-144页 |
| ·毒株、细胞、实验动物 | 第141页 |
| ·主要试剂 | 第141页 |
| ·引物设计及合成 | 第141-142页 |
| ·E2基因PCR扩增 | 第142页 |
| ·sE2基因PCR扩增 | 第142页 |
| ·重组表达载体pGEX-4T-1-sE2的构建 | 第142-143页 |
| ·SD0803 sE2基因诱导表达及表达产物纯化 | 第143页 |
| ·抗rsE2蛋白多克隆抗体的制备及纯化 | 第143页 |
| ·多克隆抗体的鉴定 | 第143-144页 |
| ·间接ELISA抗体效价的测定 | 第143-144页 |
| ·Western-blot抗体特异性检测 | 第144页 |
| ·BVDV检测 | 第144页 |
| 2. 结果 | 第144-147页 |
| ·SD0803 E2及sE2基因扩增 | 第144-145页 |
| ·重组质粒rsE2的构建 | 第145页 |
| ·SD0803 rsE2基因诱导表达及重组蛋白的鉴定 | 第145-146页 |
| ·抗rsE2蛋白多克隆抗体的制备 | 第146页 |
| ·抗体特异性鉴定 | 第146-147页 |
| ·Western-blot分析 | 第146页 |
| ·BVDV抗原检测 | 第146-147页 |
| 3. 讨论 | 第147-148页 |
| Abstract | 第148-149页 |
| 全文结论 | 第149-151页 |
| 参考文献 | 第151-166页 |
| 致谢 | 第166-167页 |
| 作者简介 | 第167-169页 |
