| 摘要 | 第1-6页 |
| ABSTRACT | 第6-15页 |
| 第一章 前言 | 第15-41页 |
| 1 鱼类免疫系统概述 | 第15-25页 |
| ·免疫器官和组织 | 第16-17页 |
| ·胸腺(thymus) | 第16页 |
| ·肾脏(kidney) | 第16页 |
| ·脾脏(spleen) | 第16-17页 |
| ·粘膜淋巴组织(MALT) | 第17页 |
| ·免疫细胞 | 第17-21页 |
| ·淋巴细胞 | 第17页 |
| ·吞噬细胞 | 第17-20页 |
| ·粒细胞(granulocyte) | 第18页 |
| ·单核／巨噬细胞(monocyte / macrophage) | 第18-19页 |
| ·巨噬细胞的活化及对病原体的天然防御作用 | 第19-20页 |
| ·非特异性细胞毒性细胞(nonspecific cytotoxic cell) | 第20-21页 |
| ·体液免疫因子 | 第21-25页 |
| ·微生物生长抑制物(microbial growth inhibitory substance) | 第21页 |
| ·补体(complement) | 第21页 |
| ·干扰素(INF) | 第21页 |
| ·凝集素(agglutinin) | 第21-22页 |
| ·溶菌酶(lysozyme) | 第22页 |
| ·C 反应蛋白(C reactive protein，CRP) | 第22页 |
| ·细胞因子(cytokines) | 第22-25页 |
| 2 鱼类重要细胞因子 IL-1β | 第25-28页 |
| ·IL-1β生物学特性 | 第25-28页 |
| ·IL-1 家族 | 第25页 |
| ·IL-1β的分子结构 | 第25-26页 |
| ·IL-1β的生物学作用 | 第26页 |
| ·IL-1β的合成及分泌 | 第26-27页 |
| ·IL-1β的合成及分泌的调节 | 第27-28页 |
| ·鱼类IL-1β的研究 | 第28页 |
| 3 细胞胞吐及分泌的分子机制－SNARE 假说 | 第28-36页 |
| ·SNARE 蛋白简介 | 第29-36页 |
| ·SNARE 家族 | 第29-31页 |
| ·SNARE 蛋白功能(Rothman-S?ller 假说) | 第31-32页 |
| ·重要 SNARE 蛋白简介 | 第32-36页 |
| ·VAMP 亚家族 | 第32页 |
| ·Syntaxin 亚家族 | 第32-33页 |
| ·SNAP-25 亚家族 | 第33页 |
| ·SNAP-25 蛋白 | 第33-34页 |
| ·SNAP-23 蛋白 | 第34-36页 |
| 4 SNARE 蛋白在非特异性免疫反应中调节作用的研究进展 | 第36-39页 |
| ·SNARE 蛋白在TNFα分泌中的作用-J.L.Stow 相关研究工作 | 第36-38页 |
| ·SNARE 是吞噬体成形的必需要素-W.S.Trimble 相关研究工作 | 第38-39页 |
| 5 本项研究的立题依据和意义 | 第39-40页 |
| 6 研究技术路线 | 第40-41页 |
| 第二章 LPS 刺激后鲈鱼巨噬细胞的超微结构变化 | 第41-55页 |
| 1 材料与方法 | 第42-44页 |
| ·材料 | 第42页 |
| ·实验动物 | 第42页 |
| ·主要试剂 | 第42页 |
| ·实验仪器 | 第42页 |
| ·方法 | 第42-44页 |
| ·配制溶液 | 第42-43页 |
| ·鲈鱼巨噬细胞的分离纯化及培养 | 第43-44页 |
| ·鲈鱼巨噬细胞的培养 | 第44页 |
| ·LPS 刺激鲈鱼巨噬细胞 | 第44页 |
| ·透射电镜观察 | 第44页 |
| 2 实验结果 | 第44-50页 |
| ·鲈鱼巨噬细胞的分离纯化 | 第44-45页 |
| ·初分细胞的成活率 | 第45页 |
| ·初分细胞贴壁情况镜检 | 第45-47页 |
| ·分离细胞的成活率 | 第47页 |
| ·鲈鱼巨噬细胞的培养与LPS 刺激 | 第47-48页 |
| ·鲈鱼巨噬细胞的超微结构 | 第48-50页 |
| 3 讨论 | 第50-54页 |
| ·初分细胞纯度保证 | 第50页 |
| ·初分细胞的贴壁效率 | 第50-51页 |
| ·鲈鱼巨噬细胞的培养条件 | 第51页 |
| ·LPS 对鲈鱼巨噬细胞的影响 | 第51-52页 |
| ·LPS 刺激强化了鲈鱼巨噬细胞的吞噬能力 | 第52-54页 |
| 4 结论 | 第54-55页 |
| 第三章 LPS 刺激下鲈鱼关键细胞因子与主要SNARE 蛋白的表达 | 第55-79页 |
| 1 材料与方法 | 第56-65页 |
| ·材料 | 第56-57页 |
| ·巨噬细胞 | 第56页 |
| ·主要试剂 | 第56-57页 |
| ·实验仪器 | 第57页 |
| ·方法 | 第57-65页 |
| ·配制溶液 | 第57-59页 |
| ·CaC12 方法制备感受态细胞 | 第59页 |
| ·鲈鱼 SNAP-23 和Syntaxi113 部分基因的克隆 | 第59-61页 |
| ·基因特异性引物的设计 | 第59-60页 |
| ·巨噬细胞总 RNA 的提取 | 第60页 |
| ·逆转录合成第一条cDNA 链 | 第60页 |
| ·PCR 扩增鲈鱼SNAP-23 基因和Syntaxi113 基因的部分片段 | 第60页 |
| ·扩增片段亚克隆入 T 载体 | 第60-61页 |
| ·感受态细胞的转化及PCR 阳性克隆的检测 | 第61页 |
| ·测序结果的验证 | 第61页 |
| ·SNARE 基因和细胞因子基因在LPS 刺激前后的表达变化 | 第61-62页 |
| ·设计基因特异性引物 | 第61页 |
| ·制备不同刺激时段的cDNA 模板 | 第61页 |
| ·Real-time 定量 PCR | 第61页 |
| ·定量 PCR 仪输出数据分析 | 第61-62页 |
| ·免疫印迹检测SNAP-23 蛋白在LPS 刺激前后的表达变化 | 第62-65页 |
| ·总蛋白的提取 | 第62页 |
| ·Bandford 方法测定蛋白含量 | 第62-63页 |
| ·SDS-PAGE | 第63页 |
| ·蛋白转印 | 第63-64页 |
| ·免疫反应 | 第64-65页 |
| ·酶联免疫吸附试验检测 IL-1β在LPS 刺激前后的分泌变化 | 第65页 |
| 2 实验结果 | 第65-70页 |
| ·基因特异性 PCR 引物 | 第65页 |
| ·RT-PCR 扩增鲈鱼SNAP-23 基因和Syntaxi113 基因部分序列 | 第65-67页 |
| ·Real-time PCR 检测各相关基因在LPS 刺激前后的表达变化 | 第67-69页 |
| ·SNAP-23 蛋白在LPS 刺激前后表达量的变化 | 第69页 |
| ·IL-1β在LPS 刺激前后的分泌量的变化 | 第69-70页 |
| 3 讨论 | 第70-73页 |
| ·LPS 刺激浓度的选择 | 第70-71页 |
| ·TNFα, IL-1β和IL-8 的起始转录顺序 | 第71-72页 |
| ·VAMP2 基因在LPS 刺激前后的变化情况 | 第72页 |
| ·SNARE 基因和细胞因子基因的选择 | 第72-73页 |
| 4 结论 | 第73-74页 |
| 附录 部分重要原始数据 | 第74-79页 |
| 附一 Real-time PCR 样品排布图 | 第74页 |
| 附二 Real-time PCR 仪读取各待测基因样品的扩增和溶解曲线 | 第74-76页 |
| 附三 Real-time PCR 仪输出原始数据的加工处理 | 第76页 |
| 附四 Bandford 方法测定蛋白含量原始结果 | 第76-77页 |
| 附五 免疫印迹条带光密度值及其换算比率 | 第77页 |
| 附六 ELISA 实验酶标仪读取原始 O.D.值 | 第77-79页 |
| 第四章 鲈鱼 SNAP-23 基因的克隆 | 第79-93页 |
| 1 材料与方法 | 第80-83页 |
| ·材料 | 第80页 |
| ·主要试剂 | 第80页 |
| ·实验仪器 | 第80页 |
| ·方法 | 第80-83页 |
| ·5`RACE-PCR | 第80-82页 |
| ·设计合成基因特异性反向引物 | 第80页 |
| ·cDNA 反链的生成和5`端加尾 | 第80-81页 |
| ·第一轮5`RACE-PCR | 第81页 |
| ·第二轮5`RACE-PCR | 第81页 |
| ·扩增片段亚克隆入 T 载体 | 第81-82页 |
| ·3`RACE-PCR | 第82-83页 |
| ·设计合成基因特异性正向引物 | 第82页 |
| ·cDNA 反链的生成 | 第82页 |
| ·第一轮3`RACE-PCR | 第82页 |
| ·第二轮3`RACE-PCR | 第82页 |
| ·扩增片段亚克隆入 T 载体 | 第82-83页 |
| ·测序结果拼接获得全长序列 | 第83页 |
| ·氨基酸序列同源性分析 | 第83页 |
| 2 结果 | 第83-90页 |
| ·5`RACE-PCR | 第83-85页 |
| ·引物设计 | 第83-84页 |
| ·PCR 扩增 | 第84页 |
| ·扩增结果测序 | 第84-85页 |
| ·3`RACE-PCR | 第85-87页 |
| ·引物设计 | 第85-86页 |
| ·PCR 扩增 | 第86页 |
| ·扩增结果测序 | 第86-87页 |
| ·拼接获得鲈鱼 SNAP-23 全长基因 | 第87-89页 |
| ·氨基酸序列同源性分析 | 第89-90页 |
| 3 讨论 | 第90-91页 |
| ·5`RACE 实验中引物Ad5RT 和Ad5R 的修改 | 第90-91页 |
| ·SNAP-25 亚家族的分子进化 | 第91页 |
| 4 结论 | 第91-92页 |
| 附录 用于 SNAP-25 蛋白亚家族同源性分析的氨基酸序列 | 第92-93页 |
| 第五章 SNAP-23 对IL-1β分泌的调节作用研究 | 第93-116页 |
| 1 材料与方法 | 第94-100页 |
| ·材料 | 第94页 |
| ·主要试剂 | 第94页 |
| ·实验仪器 | 第94页 |
| ·方法 | 第94-100页 |
| ·鲈鱼SNAP-23和IL-1β全长基因定向克隆 | 第94-96页 |
| ·PCR 引物设计 | 第95页 |
| ·载体制备 | 第95页 |
| ·PCR 扩增反应 | 第95-96页 |
| ·PCR 扩增产物克隆入载体 | 第96页 |
| ·鲈鱼SNAP-23 突变基因的定向克隆 | 第96-98页 |
| ·PCR 引物设计 | 第96-97页 |
| ·PCR 扩增反应 | 第97-98页 |
| ·PCR 扩增产物克隆入pEGFP-C2 载体 | 第98页 |
| ·融合质粒的表达 | 第98-100页 |
| ·质粒提取 | 第98页 |
| ·质粒定量分析 | 第98-99页 |
| ·体外瞬时转染及融合蛋白的检测 | 第99页 |
| ·SNAP-23 及突变体的表达对IL-1β分泌的影响 | 第99-100页 |
| 2 结果 | 第100-105页 |
| ·定向插入片段的扩增和融合载体的酶切验证 | 第100-101页 |
| ·根据测序结果最终验证融合质粒构建的准确性 | 第101-103页 |
| ·ELISA 检测各种情况下IL-1β的分泌 | 第103-104页 |
| ·GFP/YFP 融合蛋白的表达检测 | 第104-105页 |
| 3 讨论 | 第105-113页 |
| ·真核表达载体的选择 | 第105-106页 |
| ·融合质粒的构建策略 | 第106-107页 |
| ·SNAP-23 野生型的表达促进了IL-1β的分泌 | 第107-108页 |
| ·SNAP-23 突变体的表达对IL-1β分泌的影响 | 第108-112页 |
| ·IL-1β分子在鲈鱼巨噬细胞内的分布 | 第112-113页 |
| 4 结论 | 第113-114页 |
| 附录一 真核表达质粒图谱及多克隆位点序列 | 第114-115页 |
| 附录二 质粒DNA 的定量分析 | 第115-116页 |
| 第六章 结论 | 第116-117页 |
| 参考文献 | 第117-131页 |
| 发表文章 | 第131-132页 |
| 致谢 | 第132页 |
