| 军事医学科学院研究生学位论文独创性声明 | 第1页 |
| 军事医学科学院研究生学位论文版权使用授权书 | 第2-7页 |
| 中文摘要 | 第7-9页 |
| ABSTRACT | 第9-11页 |
| 1.前言 | 第11-17页 |
| ·古老的烈性自然疫源性疾病——鼠疫 | 第11-12页 |
| ·鼠疫菌病原学特性 | 第12-13页 |
| ·PhoP-PhoQ控制感染早期阶段鼠疫菌在巨噬细胞内的寄生能力 | 第13-16页 |
| ·鼠疫菌的胞内寄生能力 | 第13页 |
| ·鼠疫菌的抗菌肽抗性 | 第13-14页 |
| ·PhoP-PhoQ控制着鼠疫菌的胞内寄生能力 | 第14-16页 |
| ·本研究的目的 | 第16-17页 |
| 2.材料 | 第17-23页 |
| ·菌株,质粒 | 第17页 |
| ·菌株 | 第17页 |
| ·质粒 | 第17页 |
| ·酶,试剂盒 | 第17页 |
| ·试剂,溶液,药品 | 第17-22页 |
| ·主要仪器 | 第22-23页 |
| 3.方法 | 第23-41页 |
| ·△phoP突变株的构建 | 第23-25页 |
| ·突变盒引物的设计与突变盒的扩增 | 第23-24页 |
| ·感受态细胞制备 | 第24页 |
| ·电转化 | 第24页 |
| ·重组克隆的筛选鉴定 | 第24-25页 |
| ·鼠疫菌总RNA的提取 | 第25-26页 |
| ·菌体收集和RNA固定 | 第25页 |
| ·菌体裂解 | 第25页 |
| ·沉淀核酸 | 第25页 |
| ·消化DNA | 第25页 |
| ·沉淀RNA | 第25-26页 |
| ·总RNA的荧光素标记 | 第26-27页 |
| ·逆转录生成氨基标记的cDNA | 第26页 |
| ·氨基标记cDNA纯化 | 第26-27页 |
| ·氨基标记cDNA的荧光素标记与纯化 | 第27页 |
| ·芯片杂交及数据分析 | 第27-28页 |
| ·芯片的紫外交联与醛基封闭 | 第27页 |
| ·芯片的预杂交 | 第27页 |
| ·芯片杂交与漂洗 | 第27-28页 |
| ·数据分析 | 第28页 |
| ·低镁刺激元(10μM MgCl_2)分析及PhoP调控元分析 | 第28-29页 |
| ·低镁刺激元(10μM MgCl_2)分析 | 第28页 |
| ·PhoP调控元分析 | 第28-29页 |
| ·PhoP蛋白的克隆,表达和纯化 | 第29-31页 |
| ·引物设计及合成 | 第29页 |
| ·产物的扩增与连接 | 第29-30页 |
| ·连接产物转化感受态大肠杆菌BL21(DE3) | 第30页 |
| ·阳性克隆的挑选及目的蛋白的表达 | 第30页 |
| ·目的蛋白的纯化 | 第30页 |
| ·蛋白浓度的测定 | 第30-31页 |
| ·凝胶迁移实验(electrophoretic mobility shift assays,EMSA) | 第31-36页 |
| ·目的DNA片断的合成 | 第31-34页 |
| ·探针的标记 | 第34-35页 |
| ·结合百分比的测定 | 第35页 |
| ·未结合的标记物的去除 | 第35页 |
| ·结合反应 | 第35-36页 |
| ·DNA酶Ⅰ足迹实验(DNase Ⅰ footprinting assays) | 第36-38页 |
| ·寡核苷酸序列5’平末端标记 | 第36页 |
| ·PCR及PCR产物的纯化 | 第36-37页 |
| ·结合反应 | 第37页 |
| ·足迹实验： | 第37页 |
| ·PhoP结合位点的生物信息学分析 | 第37-38页 |
| ·引物延伸实验(primer extension assays) | 第38-39页 |
| ·与靶基因mRNA互补引物的设计 | 第38页 |
| ·总RNA的提取 | 第38页 |
| ·寡核苷酸探针的制备 | 第38页 |
| ·引物延伸反应 | 第38-39页 |
| ·测序反应 | 第39-41页 |
| ·寡核苷酸引物的标记： | 第39页 |
| ·延伸／终止反应 | 第39-41页 |
| 4.结果 | 第41-62页 |
| ·△phoP突变株的构建 | 第41页 |
| ·PhoP调控子的转录谱分析 | 第41-46页 |
| ·低镁刺激元研究 | 第42页 |
| ·PhoP调控元研究 | 第42-46页 |
| ·PhoP蛋白的表达纯化 | 第46-47页 |
| ·分子生化实验 | 第47-62页 |
| ·凝胶迁移实验(EMSA) | 第47-51页 |
| ·DNA酶Ⅰ足迹实验 | 第51-58页 |
| ·引物延伸实验 | 第58-62页 |
| 5.讨论 | 第62-75页 |
| ·鼠疫菌的新整体调控子——PhoP转录调控蛋白 | 第62-68页 |
| ·调节镁离子转运 | 第63-64页 |
| ·应激保护作用的调节 | 第64-65页 |
| ·重塑肽聚糖和修饰脂多糖(LPS) | 第65-67页 |
| ·PhoP对细胞代谢过程的影响 | 第67-68页 |
| ·广泛调控作用 | 第68页 |
| ·PhoP结合位点 | 第68-70页 |
| ·PhoP-PhoQ调控鼠疫菌的胞内寄生能力 | 第70-75页 |
| ·抵抗吞噬溶酶体的低pH环境 | 第71页 |
| ·保持菌体镁环境的自稳态 | 第71-72页 |
| ·保护菌体蛋白和DNA免受损伤 | 第72-73页 |
| ·抗菌肽抗性 | 第73-75页 |
| 6.结语 | 第75-76页 |
| 参考文献 | 第76-81页 |
| 二元调控系统PHOP-PHOQ在细菌中的调控作用 | 第81-88页 |
| 致谢 | 第88页 |
