| 中文摘要 | 第1-15页 |
| 英文摘要 | 第15-18页 |
| 第一部分 绪论 | 第18-28页 |
| 第一章 垂体腺苷酸环化酶激活多肽的研究概况 | 第18-23页 |
| ·PACAP及其受体 | 第18-19页 |
| ·PACAP的生物学功能 | 第19-21页 |
| ·PACAP受体的特异激动剂和拮抗剂 | 第21-23页 |
| 第二章 蛋白内含肽及其应用 | 第23-26页 |
| ·蛋白内含肽简介 | 第23-24页 |
| ·蛋白内含肽介导蛋白纯化 | 第24页 |
| ·蛋白内含肽介导蛋白环化 | 第24-26页 |
| 第三章 研究目的、研究意义及研究内容 | 第26-28页 |
| ·研究目的 | 第26页 |
| ·研究意义及研究内容 | 第26-28页 |
| 第二部分 重组PACAP的研制 | 第28-54页 |
| 第四章 非融合rhPACAP的制备及一种提高Xa因子酶切效率的策略 | 第28-43页 |
| ·前言 | 第28页 |
| ·材料与方法 | 第28-33页 |
| ·主要试剂 | 第28页 |
| ·质粒、菌种和细胞 | 第28-29页 |
| ·人工合成rhPACAP基因 | 第29-30页 |
| ·表达质粒的构建 | 第30页 |
| ·融合蛋白的表达 | 第30-31页 |
| ·融合蛋白的纯化 | 第31页 |
| ·Xa因子水解融合蛋白效率比较 | 第31页 |
| ·rhPACAP的纯化 | 第31页 |
| ·rhPACAP的HPLC鉴定 | 第31页 |
| ·rhPACAP的活性测定 | 第31-32页 |
| ·cAMP浓度测定 | 第32-33页 |
| ·结果 | 第33-40页 |
| ·表达质粒的构建及融合蛋白的表达、纯化和鉴定 | 第33-34页 |
| ·融合蛋白的酶解和短肽的引入对酶切效率的影响 | 第34-37页 |
| ·rhPACAP多肽的纯化和鉴定 | 第37-38页 |
| ·rhPACAP的活性测定 | 第38-40页 |
| ·讨论 | 第40-41页 |
| ·非融合rhPACAP的制备 | 第40页 |
| ·柔性短肽的引入提高Xa因子酶切效率 | 第40-41页 |
| ·小结 | 第41-43页 |
| 第五章 蛋白内含肽介导RMPACAP的高效制备 | 第43-54页 |
| ·前言 | 第43页 |
| ·材料与方法 | 第43-47页 |
| ·主要试剂 | 第43页 |
| ·质粒、菌种和细胞 | 第43-44页 |
| ·编码RMPACAP基因的构建 | 第44-45页 |
| ·重组表达载体pKY-PAC的构建 | 第45页 |
| ·融合蛋白的表达 | 第45页 |
| ·RMPACAP的纯化 | 第45-46页 |
| ·RMPACAP的活性测定 | 第46页 |
| ·蛋白测定 | 第46页 |
| ·Tricine-SDS-PAGE | 第46-47页 |
| ·结果 | 第47-51页 |
| ·RMPACAP基因的构建和重组表达载体pKY-PAC的构建 | 第47页 |
| ·融合蛋白亲和层析和诱导蛋白内含肽在柱切割 | 第47-48页 |
| ·RMPACAP的体外活性测定 | 第48-51页 |
| ·讨论 | 第51-53页 |
| ·RMPACAP的制备效率 | 第51-52页 |
| ·RMPACAP的生物活性 | 第52-53页 |
| ·小结 | 第53-54页 |
| 第三部分 VPAC2受体特异激动剂的研制、筛选、鉴定及改造 | 第54-77页 |
| 第六章、VPAC2受体特异激动剂的设计、制备及活性测定 | 第54-71页 |
| ·前言 | 第54-57页 |
| ·已确定的受体激动剂和拮抗剂及其应用 | 第54-55页 |
| ·VPAC2受体激动剂的设计原则 | 第55-56页 |
| ·新型VPAC2受体激动剂的设计及制备方案 | 第56-57页 |
| ·材料与方法 | 第57-62页 |
| ·主要试剂 | 第57-58页 |
| ·质粒和菌种 | 第58页 |
| ·编码RMROM和RROM基因的构建 | 第58-59页 |
| ·编码RMBAY和RBAY基因的构建 | 第59页 |
| ·重组表达载体pKY-ROM、pKY-BAY的构建 | 第59-60页 |
| ·重组表达载体pTYB-ROM、pTYB-BAY的构建 | 第60页 |
| ·RMROM和RMBAY的制备 | 第60-61页 |
| ·RROM和RBAY的制备 | 第61-62页 |
| ·RMPACAP断裂产物C-RMP的产生和鉴定 | 第62页 |
| ·重组多肽的降血糖活性测定方法 | 第62页 |
| ·结果 | 第62-71页 |
| ·重组表达载体pKY-ROM、pKY-BAY的构建 | 第62页 |
| ·重组表达载体pTYB-ROM、pTYB-BAY的构建 | 第62-65页 |
| ·RMROM和RMBAY的制备 | 第65-68页 |
| ·RROM和RBAY的制备 | 第68-70页 |
| ·C-RMP的产生和鉴定 | 第70-71页 |
| ·重组多肽降血糖的活性测定 | 第71页 |
| ·讨论 | 第71-75页 |
| ·重组多肽的制备及其制备效率的比较 | 第71-73页 |
| ·重组多肽降糖活性的比较与分析 | 第73-74页 |
| ·对降糖活性测定方法的讨论 | 第74页 |
| ·多肽硫酯的水解 | 第74页 |
| ·多肽硫酯的断裂 | 第74-75页 |
| ·C-RMP的生物活性 | 第75页 |
| ·小结 | 第75-77页 |
| 第七章 重组多肽对VPAC2型受体特异性和激动性的检测 | 第77-90页 |
| ·前言 | 第77页 |
| ·材料与方法 | 第77-81页 |
| ·主要试剂 | 第77页 |
| ·质粒和细胞 | 第77-78页 |
| ·表达载体pcDNA-PAC1的构建 | 第78页 |
| ·重组表达质粒转染CHO细胞 | 第78-79页 |
| ·分别高效表达3个受体的CHO细胞筛选 | 第79页 |
| ·RT-PCR鉴定PAC1、VPAC1和VPAC2受体的表达 | 第79页 |
| ·Western bolt鉴定VPAC1和VPAC2受体的表达 | 第79-80页 |
| ·Immunofluorescenece assay鉴定受体的表达 | 第80页 |
| ·~(125)I-PACAP38检测PAC1受体表达 | 第80页 |
| ·配体与受体的竞争性结合实验 | 第80-81页 |
| ·RMBAY激活VAPC2受体的活性测定 | 第81页 |
| ·结果 | 第81-87页 |
| ·重组表达载体的鉴定 | 第81-83页 |
| ·RT-PCR检测VPAC1、VPAC2和PAC1受体表达 | 第83页 |
| ·Western blot和免疫荧光检测VPAC1和VPAC2受体的表达 | 第83页 |
| ·~(125)I-PACAP38配体结合实验检测PAC1受体的表达 | 第83-84页 |
| ·RMPACAP和RMBAY对受体选择特异性 | 第84-86页 |
| ·RMBAY和RMPACAP促进cAMP生成的活性测定 | 第86-87页 |
| ·讨论 | 第87-89页 |
| ·三个受体的特异高效表达及应用 | 第87-88页 |
| ·RMBAY的受体选择性和激动性 | 第88页 |
| ·PACAP受体与Ⅱ型糖尿病 | 第88-89页 |
| ·小结 | 第89-90页 |
| 第八章 重组环肽RCBAY的制备和活性测定 | 第90-102页 |
| ·前言 | 第90-91页 |
| ·环肽的优势 | 第90页 |
| ·蛋白内含肽介导环肽制备的工艺 | 第90-91页 |
| ·材料与方法 | 第91-95页 |
| ·试剂、质粒与菌种 | 第91-92页 |
| ·RCBAY环肽线性前体的基因设计 | 第92-93页 |
| ·重组表达载体pTW-BAY的构建 | 第93页 |
| ·融合蛋白的表达 | 第93-94页 |
| ·RCBAY的制备 | 第94页 |
| ·RCBAY的体外降血糖活性测定 | 第94-95页 |
| ·结果 | 第95-100页 |
| ·重组表达载体pTW-BAY的构建 | 第95页 |
| ·融合蛋白表达和亲和层析 | 第95-96页 |
| ·蛋白内含肽的可诱导切割及目的环肽的制备和鉴定 | 第96-99页 |
| ·RCBAY的活性测定 | 第99-100页 |
| ·讨论 | 第100-101页 |
| ·环肽制备产物的活性 | 第100页 |
| ·环化效率 | 第100-101页 |
| ·工艺特点 | 第101页 |
| ·小结 | 第101-102页 |
| 第九章、菌种RMBAY-ER2566的中试发酵探索 | 第102-109页 |
| ·前言 | 第102页 |
| ·材料和方法 | 第102页 |
| ·上罐前参数探索条件 | 第102页 |
| ·蛋白电泳条件 | 第102页 |
| ·发酵条件 | 第102页 |
| ·结果 | 第102-107页 |
| ·RMBAY-ER2566的生长曲线 | 第102-103页 |
| ·诱导时间的选择 | 第103页 |
| ·诱导剂IPTG的用量 | 第103页 |
| ·IPTG诱导温度及诱导时间的筛选 | 第103-105页 |
| ·碳源的筛选 | 第105-106页 |
| ·发酵罐(5L)发酵 | 第106-107页 |
| ·讨论 | 第107-108页 |
| ·小结 | 第108-109页 |
| 结论、创新与不足之处 | 第109-112页 |
| 参考文献 | 第112-123页 |
| 附录 | 第123-145页 |
| 1、rhPACAP的飞行质谱 | 第123-124页 |
| 2、pKY-PAC的测序结果 | 第124-125页 |
| 3、RMPACAP的飞行质谱 | 第125-126页 |
| 4、pKY-ROM的测序结果 | 第126-127页 |
| 5、pKY-BAY的测序结果 | 第127-128页 |
| 6、pTYB-ROM的测序结果 | 第128-129页 |
| 7、pTYB-BAY的测序结果 | 第129-130页 |
| 8、新鲜制备的RMPACAP的飞行质谱 | 第130-131页 |
| 9、C-RMB的飞行质谱1 | 第131-132页 |
| 10、C-RMB的飞行质谱2 | 第132-133页 |
| 11、pTW-BAY的测序结果 | 第133-134页 |
| 12、RMBAY制备产物的飞行质谱 | 第134-135页 |
| 13、透析前RCBAY制备产物飞行质谱 | 第135-136页 |
| 14、透析后RCBAY制备产物飞行质谱 | 第136-137页 |
| 15、VPAC1基因及pcDNA-VPAC1测序 | 第137-140页 |
| 16、VPAC2基因及pcDNA-VPAC2测序 | 第140-143页 |
| 17、PAC1基因及pcDNA-PAC1测序 | 第143-145页 |
| 发表文章及申请专利 | 第145-146页 |
| 致谢 | 第146页 |
