| 中文摘要 | 第1-5页 |
| 英文摘要 | 第5-10页 |
| 第一章 前言 | 第10页 |
| 1． 1 固氮酶生物化学研究 | 第10-11页 |
| 1． 1． 1 固氮酶的组成 | 第11页 |
| 1． 1． 1． 1 MoFe蛋白 | 第11-13页 |
| 1． 1． 1． 2 Fe蛋白 | 第13页 |
| 1． 1． 2 固氮酶的特性 | 第13页 |
| 1． 1． 2． 1 底物的变通性 | 第13-14页 |
| 1． 1． 2． 2 稳定性 | 第14-15页 |
| 1． 1． 2． 3 波谱特性 | 第15页 |
| 1． 1． 2． 4 ATP和还原剂 | 第15-16页 |
| 1． 1． 3 固氮酶的多样性 | 第16-18页 |
| 1． 2 固氮酶分子生物学研究 | 第18页 |
| 1． 2． 1 固氮基因的定位 | 第18-22页 |
| 1． 2． 2 环境因子对nif基因的表达调控 | 第22-23页 |
| 1． 3 固氮酶晶体学研究 | 第23页 |
| 1． 3． 1 固氮酶组分蛋白的结晶研究 | 第23-26页 |
| 1． 3． 2 固氮酶晶体学研究进展 | 第26-27页 |
| 1． 3． 2． 1 Fe蛋白 | 第27-28页 |
| 1． 3． 2． 2 MoFe蛋白 | 第28-33页 |
| 1． 3． 2． 3 固氮酶复合体 | 第33-35页 |
| 1． 4 选题的依据及研究思路 | 第35-39页 |
| 第二章 材料与方法 | 第39-55页 |
| 2． 1 棕色固氮菌的培养 | 第39-41页 |
| 2． 1． 1 培养基配制 | 第39-40页 |
| 2． 1． 1． 1 母液配制 | 第39页 |
| 2． 1． 1． 2 应用液配制 | 第39-40页 |
| 2． 1． 2 菌体培养 | 第40页 |
| 2． 1． 2． 1 斜面培养 | 第40页 |
| 2． 1． 2． 2 摇瓶培养 | 第40页 |
| 2． 1． 2． 3 小罐发酵 | 第40页 |
| 2． 1． 2． 4 菌体收集 | 第40页 |
| 2． 1． 3 菌体生长及活性测定 | 第40-41页 |
| 2． 1． 3． 1 菌体浓度检测 | 第41页 |
| 2． 1． 3． 2 突变种在限氨培养基中耗氨情况的检测 | 第41页 |
| 2． 1． 3． 3 菌体活性检测 | 第41页 |
| 2． 2 厌氧技术 | 第41-42页 |
| 2． 2． 1 氩气的纯化 | 第41-42页 |
| 2． 2． 1． 1 除氧溶液的配制 | 第41-42页 |
| 2． 2． 1． 2 除氧溶液的使用 | 第42页 |
| 2． 2． 2 厌氧操作要点 | 第42页 |
| 2． 3 固氮酶的分离纯化 | 第42-46页 |
| 2． 3． 1 含不同盐浓度的厌氧Tris-HCl缓冲液的配制 | 第42页 |
| 2． 3． 2 固氮酶的分离纯化 | 第42-45页 |
| 2． 3． 2． 1 野生种固氮酶 MoFe蛋白的分离纯化 | 第43-44页 |
| 2． 3． 2． 2 △nifE钼铁蛋白的纯化 | 第44-45页 |
| 2． 3． 2． 3 CrFe蛋白的纯化 | 第45页 |
| 2． 3． 3 部分缺失P-cluster的△nifE Av1的制备 | 第45-46页 |
| 2． 4 蛋白质浓度及活性测定 | 第46-50页 |
| 2． 4． 1 浓度测定 | 第46-48页 |
| 2． 4． 1． 1 试剂配制 | 第46-47页 |
| 2． 4． 1． 2 标准曲线制作 | 第47页 |
| 2． 4． 1． 3 样品蛋白浓度测定 | 第47-48页 |
| 2． 4． 2 活性测定 | 第48-50页 |
| 2． 4． 2． 1 Mg-ATP发生系统的配制 | 第48页 |
| 2． 4． 2． 2 FeMoco的抽提 | 第48页 |
| 2． 4． 2． 3 含Mn、Cr或Mo重组液的配制 | 第48-49页 |
| 2． 4． 2． 4 固氮酶两组分蛋白互补的C2H2和H+还原活性的测定 | 第49-50页 |
| 2． 5 蛋白质电泳及Western-blotting | 第50-53页 |
| 2． 5． 1 聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第50-52页 |
| 2． 5． 1． 1 电泳试剂配制 | 第50页 |
| 2． 5． 1． 2 不同染色方法试剂配制 | 第50-51页 |
| 2． 5． 1． 3 染色步骤 | 第51-52页 |
| 2． 5． 2 Western-blotting | 第52-53页 |
| 2． 5． 2． 1 试剂配制 | 第52页 |
| 2． 5． 2． 2 电印渍步骤 | 第52页 |
| 2． 5． 2． 3 检测 | 第52-53页 |
| 2． 6 蛋白质结晶 | 第53-55页 |
| 2． 6． 1 结晶方法 | 第53页 |
| 2． 6． 2 溶液配制 | 第53页 |
| 2． 6． 3 晶体回收鉴定 | 第53-55页 |
| 2． 6． 3． 1 离心法回收晶体 | 第53-54页 |
| 2． 6． 3． 2 挑取晶体法回收晶体 | 第54-55页 |
| 第三章 结果与讨论 | 第55-90页 |
| 3． 1 △nifE Av1的分离纯化、体外重组及结晶研究 | 第55-75页 |
| 3． 1． 1 △nifE Av1的分离纯化 | 第55-60页 |
| 3． 1． 2 △nifE Av1的体外重组 | 第60-67页 |
| 3． 1． 2． 1 FeMoco激活 | 第60-62页 |
| 3． 1． 2． 2 含Mn，Cr或Mo重组液的重组激活 | 第62-67页 |
| 3． 1． 3 △nifE Av1的结晶研究 | 第67-75页 |
| 3． 1． 3． 1 沉淀剂的影响 | 第67-73页 |
| 3． 1． 3． 2 蛋白质批次的影响 | 第73页 |
| 3． 1． 3． 3 结晶方法及实验操作的影响 | 第73-75页 |
| 3． 2 CrFe蛋白中残存细菌铁蛋白的晶体生长及鉴定 | 第75-90页 |
| 3． 2． 1 砖红色晶体的生成 | 第77-78页 |
| 3． 2． 2 砖红色晶体及棕色晶体的特性 | 第78-84页 |
| 3． 2． 3 砖红色晶体的蛋白组成 | 第84-90页 |
| 第四章 本研究主要进展与展望 | 第90-92页 |
| 4． 1 本研究主要进展 | 第90-91页 |
| 4． 1． 1 △nifE Av1纯化与体外重组的研究 | 第90页 |
| 4． 1． 2 AvBF、△nifE Av1和CrFe蛋白晶体的生长及鉴定 | 第90-91页 |
| 4． 2 本研究创新点 | 第91页 |
| 4． 3 工作展望 | 第91-92页 |
| 参考文献 | 第92-103页 |
| 缩略语 | 第103-105页 |
| 发表及参与发表的论文 | 第105-106页 |
| 致谢 | 第106-107页 |
