| 目录 | 第1-7页 |
| 中文摘要 | 第7-10页 |
| 英文摘要 | 第10-12页 |
| 前言 | 第12-29页 |
| 一、RNA干扰过程概述 | 第12-17页 |
| 1.内源性的mRNA是dsRNA作用的靶位点 | 第13页 |
| 2.DICER：RNA干扰的启动器 | 第13页 |
| 3.RdRP：RNA干扰的催化剂 | 第13-14页 |
| 4.RISC(RNA-induced silencing complex)：干扰效应器复合物 | 第14-15页 |
| 5.Argonaute：接头蛋白(Adaptor) | 第15页 |
| 6.SiRNA(Small interference RNA) | 第15-17页 |
| 二、RNA干扰在哺乳动物功能基因研究中的应用 | 第17-21页 |
| 三、RNA干扰实现的方式 | 第21-24页 |
| 四、鼠α-和β-珠蛋白基因簇结构与表达调控特点 | 第24-28页 |
| 1.鼠α-和β-珠蛋白基因簇结构 | 第24-25页 |
| 2.β-珠蛋白基因簇发育开关机制的研究 | 第25-27页 |
| ·LCR与各个珠蛋白基因之间的相对位置 | 第26页 |
| ·各个高敏位点的不同作用 | 第26页 |
| ·近端调控元件 | 第26-27页 |
| ·反式作用因子 | 第27页 |
| 3.鼠α-和β-珠蛋白基因表达平衡的研究 | 第27-28页 |
| 五、本研究的主要内容 | 第28-29页 |
| 材料与方法 | 第29-55页 |
| 一、材料 | 第29-31页 |
| 1.菌株和质粒 | 第29页 |
| 2.细胞系 | 第29页 |
| 3.限制性内切酶及其它修饰酶类 | 第29页 |
| 4.各种转染试剂 | 第29-30页 |
| 5.抗体 | 第30页 |
| 6.其它主要试剂及试剂盒 | 第30页 |
| 7.主要仪器 | 第30-31页 |
| 8.放射性核素 | 第31页 |
| 二、实验方法 | 第31-55页 |
| 1.质粒的构建 | 第34-37页 |
| ·酶切反应 | 第34页 |
| ·DNA片段回收 | 第34页 |
| ·DNA片段3’凹端的补平 | 第34页 |
| ·DNA片段3’凸端的削平 | 第34-35页 |
| ·载体的脱磷酸化 | 第35页 |
| ·连接反应 | 第35页 |
| ·感受态大肠杆菌细胞制备 | 第35-36页 |
| ·转化 | 第36页 |
| ·质粒DNA的小量制备 | 第36页 |
| ·质粒DNA的大量制备 | 第36-37页 |
| 2.细胞培养 | 第37-38页 |
| ·G418溶液配制 | 第37页 |
| ·细胞生长条件 | 第37-38页 |
| ·细胞传代 | 第38页 |
| ·复苏及冻存 | 第38页 |
| 3.细胞电穿孔转染质粒DNA | 第38-39页 |
| 4.病毒包装与转导 | 第39-40页 |
| ·病毒包装、病毒上清收集及冻存 | 第39-40页 |
| ·病毒转导靶细胞的程序 | 第40页 |
| ·DMSO诱导MEL细胞分化 | 第40页 |
| 5.转导细胞的DNA结构分析 | 第40-42页 |
| ·从转染细胞中提取基因组DNA | 第40-41页 |
| ·基因组DNA的PCR分析 | 第41页 |
| ·Southern blot分析 | 第41-42页 |
| ·酶解 | 第41页 |
| ·电泳 | 第41页 |
| ·Southern转膜 | 第41-42页 |
| ·预杂交 | 第42页 |
| ·DNA探针标记 | 第42页 |
| ·杂交 | 第42页 |
| ·洗膜及放射自显影 | 第42页 |
| 6.FACS(fluorescence activating cell sorting)定量分析发光细胞比例 | 第42-43页 |
| 7.流式细胞仪测定细胞DNA含量 | 第43页 |
| ·收集并固定细胞 | 第43页 |
| ·PI染色测定细胞周期： | 第43页 |
| 8.半定量RT-PCR检测基因的mRNA表达水平 | 第43-45页 |
| ·从细胞中提取细胞总RNA | 第43-44页 |
| ·反转录成cDNA第一链(参照产品说明) | 第44页 |
| ·半定量RT-PCR | 第44-45页 |
| 9.利用PCR和Southern杂交鉴定转基因鼠 | 第45页 |
| ·PCR法鉴定转基因鼠 | 第45页 |
| ·Southern杂交鉴定转基因鼠 | 第45页 |
| 10.转基因鼠传代 | 第45页 |
| 11.胚胎小鼠器官组织的采集和保存 | 第45-46页 |
| 12.阳性胎鼠的PCR快速鉴定 | 第46页 |
| 13.组织RNA提取 | 第46-47页 |
| 14.RNase保护实验检测细胞及转基因小鼠中人β-珠蛋白的表达 | 第47-49页 |
| ·RNA探针标记 | 第47-48页 |
| ·RNA探针纯化 | 第48页 |
| ·RNA：RNA杂交及RNase反应 | 第48-49页 |
| ·变性胶电泳及放射自显影 | 第49页 |
| 15.Western blotting检测蛋白的表达水平 | 第49-52页 |
| ·裂解细胞 | 第49-50页 |
| ·SDS-PAGE电泳 | 第50-51页 |
| ·电转移 | 第51页 |
| ·杂交 | 第51-52页 |
| 16.利用酸性解链电泳检测转基因鼠血液中β-珠蛋白的表达 | 第52-55页 |
| ·鼠溶血液的制备 | 第52页 |
| ·用酸性解链电泳检测转基因鼠血液中的珠蛋白 | 第52-53页 |
| ·蛋白质的质谱分析 | 第53-55页 |
| 实验结果 | 第55-95页 |
| 一、逆转录病毒载体介导的RNA干扰技术的建立 | 第56-67页 |
| 1.p53蛋白的逆转录病毒hU6-RNA干扰载体的构建及其干扰作用研究 | 第56-63页 |
| ·pAVU6+27-sip53-1载体的构建 | 第56-58页 |
| ·pXSN-AVU6+27-sip53-1载体的构建 | 第58-60页 |
| ·重组病毒的产生与收集 | 第60页 |
| ·抗性细胞克隆库的形成 | 第60页 |
| ·基因组DNA的PCR分析 | 第60-61页 |
| ·Western blotting检测细胞库中p53蛋白的表达 | 第61-62页 |
| ·细胞流式检测p53蛋白被抑制的细胞库中细胞周期的变化 | 第62-63页 |
| 2.p53蛋白的逆转录病毒hH1-RNA干扰载体的构建及其干扰作用研究 | 第63-67页 |
| ·pSuper-sip53-2载体的构建 | 第64-65页 |
| ·pXSN-H1-sip53-2和pXRN-H1-sip53-2载体的构建 | 第65-66页 |
| ·病毒的包装、上清的收集与靶细胞的转导 | 第66页 |
| ·Western blotting检测细胞库中p53蛋白的表达 | 第66-67页 |
| 二、利用逆转录病毒载体介导的RNA干扰技术研究鼠α、β珠蛋白基因的表达平衡 | 第67-73页 |
| 1.pXSNmU6Beta病毒载体的构建 | 第67-70页 |
| ·pBS／U6mBeta载体的构建 | 第67-68页 |
| ·pXSNmU6Beta载体的构建 | 第68-70页 |
| 2.重组病毒的收集与病毒转导靶细胞 | 第70页 |
| 3.Southern杂交检测pXSNmU6Beta在MEL细胞中的整合 | 第70页 |
| 4.RPA检测细胞中α、β-珠蛋白基因的表达 | 第70-73页 |
| 三、利用RNA干扰技术抑制小鼠中β-珠蛋白基因的表达 | 第73-95页 |
| 1.显微注射用DNA的制备与纯化 | 第73页 |
| 2.转基因鼠系的建立 | 第73-75页 |
| 3.转基因小鼠中β-珠蛋白的检测 | 第75-77页 |
| ·RPA检测转基因鼠中mRNA水平的表达 | 第75-76页 |
| ·酸性解炼电泳检测鼠血液中β-珠蛋白的表达 | 第76-77页 |
| 4.RT-PCR检测转基因鼠系中胚胎、胎儿期β-类珠蛋白的表达 | 第77-78页 |
| 5.转基因小鼠血液中表达蛋白的质谱分析 | 第78-95页 |
| ·转基因鼠系siβl中siβlm主带与B1、B2、B3鉴定与分析 | 第79-85页 |
| ·对应于正常鼠的siβl中β-globin主带(siβlm)的鉴定与分析 | 第79-80页 |
| ·B1蛋白鉴定与分析 | 第80-82页 |
| ·B2蛋白鉴定与分析 | 第82-84页 |
| ·B3蛋白鉴定与分析 | 第84-85页 |
| ·14.5天胎血条带的鉴定与分析 | 第85-92页 |
| ·14.5m蛋白鉴定与分析 | 第85-87页 |
| ·14.5-1蛋白鉴定与分析 | 第87-88页 |
| ·14.5-2蛋白鉴定与分析 | 第88-90页 |
| ·14.5-3蛋白鉴定与分析 | 第90-92页 |
| ·正常成年鼠的β-珠蛋白血液成分分析： | 第92-95页 |
| 讨论 | 第95-112页 |
| 一.本研究中RNA干扰技术的创新点 | 第95-100页 |
| 1.逆转录病毒载体介导的稳定整合的RNA干扰技术的优越性 | 第95-99页 |
| ·逆转录病毒载体介导体系易于导入细胞和筛选稳定克隆 | 第95-97页 |
| ·逆转录病毒载体介导的RNA干扰体系具有特异性和高效性 | 第97-98页 |
| ·逆转录病毒载体介导的RNA干扰在细胞水平没有引起抗病毒防御机制 | 第98-99页 |
| 2.RNA干扰技术与转基因动物技术的结合：能够在动物体中实现内源基因表达的抑制 | 第99-100页 |
| 二、运用建立的RNA干扰技术分别在细胞和整体动物中研究珠蛋白的平衡和发育开关机制 | 第100-103页 |
| 1.β-珠蛋白基因被不同程度地抑制后,MEL细胞中α-和β-珠蛋白基因表达的分析 | 第100-101页 |
| 2.转基因鼠系表达模式可能类似于14.5天胚胎期珠蛋白基因的表达模式 | 第101-103页 |
| ·β-minor蛋白可能是鼠的发育过程中的一种胎儿期血红蛋白 | 第101-102页 |
| ·转基因鼠系和14.5天的胎血中各条带与α-珠蛋白比值的比较 | 第102-103页 |
| 三、动物水平RNA干扰机制的分析 | 第103-105页 |
| 四、珠蛋白的量与转录因子依赖的β-珠蛋白开关模式 | 第105-106页 |
| 五、序列特异的siRNA干扰序列的设计分析 | 第106-108页 |
| 六、RNA干扰的应用前景 | 第108-110页 |
| 1.RNA干扰与发育调控 | 第108-109页 |
| 2.基因功能研究 | 第109-110页 |
| 3.基因治疗 | 第110页 |
| 七、本研究的不足与改进之处 | 第110-112页 |
| 小结 | 第112-113页 |
| 参考文献 | 第113-117页 |
| 文献综述 | 第117-132页 |
| 英文名词及缩写 | 第132-133页 |
| 致谢 | 第133-134页 |
| 个人简历 | 第134页 |
