| 中文摘要 | 第1-8页 |
| 英文摘要 | 第8-10页 |
| 前言 | 第10-15页 |
| 材料与方法 | 第15-30页 |
| 一、材料 | 第15-23页 |
| 1、细胞株及其培养基 | 第15页 |
| 2、实验用小鼠及饲养条件 | 第15页 |
| 3、质粒载体 | 第15-16页 |
| 4、小鼠的组织因子表达质粒结构 | 第16页 |
| 5、人的组织因子及其突变体的表达质粒结构 | 第16-18页 |
| 6、VEGF启动子区—报告基因质粒结构 | 第18-20页 |
| 7、PCR引物 | 第20页 |
| 8、主要试剂及其配制 | 第20-23页 |
| ·Avertin配制 | 第20页 |
| ·Luciferase分析缓冲液的配制 | 第20-21页 |
| ·蛋白提取液的配制 | 第21页 |
| ·几种激酶抑制剂的配制 | 第21页 |
| ·Western blot所用试剂的配置 | 第21-22页 |
| ·HBS缓冲液 | 第22页 |
| ·LacZ染色所需的试剂的配置 | 第22-23页 |
| 9、工具酶及试剂盒 | 第23页 |
| 10、主要的仪器 | 第23页 |
| 二、实验方法 | 第23-30页 |
| 1、皮肤伤口的形成 | 第23页 |
| 2、伤口局部基因的转染 | 第23-24页 |
| 3、RT-PCR反应 | 第24-26页 |
| ·小鼠伤口皮肤的mRNA RT—PCR反应体系的组成 | 第24页 |
| ·黑色素瘤细胞的mRNA RT—PCR反应体系的组成 | 第24页 |
| ·RT-PCR反应体系 | 第24页 |
| ·PCR反应体系 | 第24-26页 |
| ·鼠的TF PCR反应体系 | 第24页 |
| ·鼠的VEGF PCR反应体系 | 第24页 |
| ·鼠的α-SMA PCR反应体系 | 第24-25页 |
| ·鼠的GAPDH PCR反应体系 | 第25页 |
| ·人的TF PCR反应体系 | 第25页 |
| ·人的VEGF PCR反应体系 | 第25页 |
| ·人的GAPDH PCR反应体系 | 第25-26页 |
| 4、伤口尺寸的评估 | 第26页 |
| 5、LacZ染色 | 第26页 |
| 6、伤口血管的显示 | 第26页 |
| 7、血流的定量 | 第26页 |
| 8、TF、VEGF、α—SMA抗原的免疫组化染色 | 第26-27页 |
| 9、免疫组化蛋白表达强度的评估 | 第27页 |
| 10、伤口处脉管数目的计数 | 第27页 |
| 11、稳定表达TF细胞系的建立 | 第27页 |
| 12、凝血实验 | 第27-28页 |
| 13、用激酶抑制剂处理稳定高表达TF的细胞株 | 第28页 |
| 14、Western blot检测磷酸化和非磷酸P44／42 MAPK激酶的表达 | 第28-29页 |
| ·样品制备 | 第28页 |
| ·SDS-PAGE电泳并转膜 | 第28页 |
| ·磷酸化和非磷酸化p44／42 MAPK抗原的检测 | 第28-29页 |
| 15、luciferase测定 | 第29页 |
| ·样品制备 | 第29页 |
| ·Luciferase和β-gal的测定 | 第29页 |
| 16、VEGF mRNA稳定性的测定 | 第29-30页 |
| 实验结果 | 第30-55页 |
| 一、小鼠皮肤伤口实验 | 第30-46页 |
| 1.糖尿病鼠TF、VEGF、α-SMA表达明显延迟 | 第30-33页 |
| ·TF表达情况 | 第30-31页 |
| ·VEGF表达情况 | 第31-32页 |
| ·α-SMA的表达情况 | 第32-33页 |
| 2.伤口局部鼠的TF基因的转染促进了VEGF,α-SMA的表达 | 第33-40页 |
| ·真核表达载体pcDNA3也适于做为体内表达的质粒载体 | 第33页 |
| ·脂质体介导提高了伤口转染效率 | 第33-35页 |
| ·伤口局部转染鼠的TF,促进了鼠的VEGF,α-SMA的表达 | 第35-40页 |
| ·鼠的TF抗原的表达 | 第35页 |
| ·鼠的VEGF抗原表达 | 第35-36页 |
| ·鼠的α-SMA抗原表达 | 第36-40页 |
| 3.伤口部位鼠的TF的转染促进了糖尿病鼠伤口处的血管形成 | 第40页 |
| 4、伤口部位鼠的TF转染促进了糖尿病鼠伤口处血液循环 | 第40页 |
| 5、伤口部位鼠的TF转染促进了糖尿病鼠伤口的愈合 | 第40-43页 |
| 6、伤口局部转染人的全长TFcDNA及其突变体后,对鼠的VEGF表达的影响 | 第43-46页 |
| 二、黑色素瘤细胞中TF诱导VEGF表达 | 第46-55页 |
| 1.转染人的全长TFcDNA及其突变体对VEGF表达的影响 | 第46-48页 |
| 2.TF诱导的VEGF表达需要P44／42 MAPK的参与 | 第48-51页 |
| ·各种激酶抑制剂对VEGF表达的影响 | 第48-50页 |
| ·TF促进P44／42 MAPK的磷酸化 | 第50-51页 |
| 3.VEGF启动子区的研究 | 第51-53页 |
| 4.VEGF mRNA稳定性的研究 | 第53-55页 |
| 讨论 | 第55-71页 |
| 1.糖尿病情况下,TF的诱导表达不足,与免疫反应受抑制有关 | 第55-58页 |
| 2.TF促进伤口新血管发生的可能机制 | 第58-61页 |
| ·TF通过诱导VEGF表达促进血管发生 | 第58-60页 |
| ·TF自身具有促血管发生的功能 | 第60-61页 |
| 3.非病毒脂质体TFcDNA基因转染为临床应用提供了基础 | 第61-62页 |
| 4.黑色素瘤细胞HT144中,TF诱导VEGF表达的结构功能关系 | 第62-65页 |
| 5.TF／FVⅡa将细胞外的信号传入细胞内的可能机制 | 第65-66页 |
| 6.TF诱导VEGF表达只需要p44／42MAPK的参与 | 第66-69页 |
| 7.在黑色素瘤细胞HT144中,TF从转录和转录后调控两个水平调节VEGF表达 | 第69-71页 |
| 小结 | 第71-72页 |
| 参考文献 | 第72-85页 |
| 综述 | 第85-98页 |
| 致谢 | 第98页 |
