| 中文摘要 | 第1-12页 |
| ABSTRACT | 第12-15页 |
| 第一章 文献综述 | 第15-34页 |
| 引言 | 第15页 |
| 1 脂肪酶的分类 | 第15-21页 |
| 2 脂肪酶产生菌及其筛选 | 第21-23页 |
| ·脂肪酶产生菌 | 第21-22页 |
| ·脂肪酶产生菌的筛选 | 第22-23页 |
| 3 脂肪酶的催化机理及其底物特异性 | 第23-26页 |
| ·脂肪酶的催化机理 | 第23-24页 |
| ·脂肪酶的底物特异性 | 第24-26页 |
| ·脂肪酸特异性 | 第24-25页 |
| ·位置特异性 | 第25页 |
| ·立体特异性 | 第25-26页 |
| 4 脂肪酶的活力测定 | 第26-27页 |
| 5 脂肪酶的应用 | 第27-31页 |
| ·脂肪酶在洗涤剂行业的应用 | 第28页 |
| ·脂肪酶在食品加工行业的应用 | 第28-29页 |
| ·脂肪酶在医药行业的应用 | 第29页 |
| ·脂肪酶在纺织行业的应用 | 第29-30页 |
| ·脂肪酶在饲料行业中的应用 | 第30页 |
| ·脂肪酶在制备生物柴油方面的应用 | 第30-31页 |
| 本研究的立题依据、研究内容及技术路线 | 第31-34页 |
| 1 立题依据 | 第31-32页 |
| 2 研究内容 | 第32-33页 |
| 3 技术路线 | 第33-34页 |
| 第二章 疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶的基因克隆及其序列分析 | 第34-80页 |
| 第一节 疏棉状嗜热丝孢菌热稳定脂肪酶LGY 的基因克隆及序列分析 | 第35-62页 |
| 1 材料和方法 | 第35-49页 |
| ·材料 | 第35-37页 |
| ·供试菌株 | 第35页 |
| ·菌株与质粒 | 第35页 |
| ·酶和生化试剂 | 第35页 |
| ·仪器 | 第35-36页 |
| ·溶液及培养基配制 | 第36-37页 |
| ·培养基 | 第36页 |
| ·溶液配制 | 第36-37页 |
| ·疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶基因lgy 的cDNA 克隆 | 第37-45页 |
| ·引物设计 | 第37-38页 |
| ·总RNA 的提取（Trizol 法） | 第38页 |
| ·紫外检测RNA 产率和纯度 | 第38-39页 |
| ·反转录cDNA 第一链的合成 | 第39页 |
| ·目的基因cDNA 中间片段的扩增 | 第39-44页 |
| ·目的基因cDNA 中间片段的扩增 | 第39-40页 |
| ·PCR 产物回收 | 第40-41页 |
| ·目的片段与载体连接 | 第41页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 | 第41-43页 |
| ·大肠杆菌感受态的制备 | 第41-42页 |
| ·大肠杆菌感受态的转化 | 第42-43页 |
| ·重组质粒的筛选与鉴定 | 第43-44页 |
| ·IPTG-X-gal 筛选 | 第43页 |
| ·菌落PCR 检测 | 第43页 |
| ·碱法小量提取质粒DNA | 第43-44页 |
| ·质粒DNA 的酶切鉴定 | 第44页 |
| ·序列测定 | 第44页 |
| ·目的基因3’末端的分离（3’RACE） | 第44-45页 |
| ·目的基因DNA 序列和全长cDNA 的克隆 | 第45-49页 |
| ·引物设计 | 第45页 |
| ·菌丝体DNA 的抽提 | 第45-46页 |
| ·脂肪酶基因DNA 序列中间片段的PCR 扩增 | 第46-47页 |
| ·脂肪酶基因DNA 序列5’端片段的TAIL-PCR 扩增 | 第47-48页 |
| ·脂肪酶基因DNA 与全长cDNA 序列的克隆 | 第48页 |
| ·脂肪酶基因全长序列的生物信息学分析 | 第48-49页 |
| 2 结果与分析 | 第49-62页 |
| ·疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶基因lgy 扩增模板的提取 | 第49-50页 |
| ·疏棉状嗜热丝孢菌总RNA 的提取 | 第49页 |
| ·疏棉状嗜热丝孢菌 Genomic DNA 的提取 | 第49-50页 |
| ·疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶基因lgy 全长cDNA 与DNA 序列的扩增 | 第50-56页 |
| ·脂肪酶基因lgy 中间片段的分离 | 第50-52页 |
| ·脂肪酶基因lgy cDNA 3’-末端的分离 | 第52-53页 |
| ·脂肪酶基因lgy DNA 序列5’-末端的分离 | 第53-55页 |
| ·脂肪酶基因lgy 全长序列的扩增 | 第55-56页 |
| ·脂肪酶基因lgy 的核苷酸序列和氨基酸序列分析 | 第56-62页 |
| ·脂肪酶基因lgy 的核苷酸序列分析 | 第57-58页 |
| ·脂肪酶基因lgy 的氨基酸序列分析 | 第58-61页 |
| ·脂肪酶LGY 的立体结构预测 | 第61-62页 |
| 第二节 疏棉状嗜热丝孢菌热稳定脂肪酶LN 的基因克隆及序列分析.. | 第62-80页 |
| 1 材料和方法 | 第62-65页 |
| ·材料 | 第62页 |
| ·实验方法 | 第62-65页 |
| ·引物设计 | 第62-63页 |
| ·总RNA 的提取（Trizol 法） | 第63页 |
| ·紫外检测RNA 产率和纯度 | 第63页 |
| ·反转录cDNA 第一链的合成 | 第63页 |
| ·目的基因cDNA 中间片段的分离 | 第63-64页 |
| ·目的基因3’末端的分离（3’-RACE） | 第64页 |
| ·目的基因ln 全长cDNA 的克隆 | 第64-65页 |
| ·目的基因ln 的Genomic DNA 序列的扩增 | 第65页 |
| ·目的基因全长序列的生物信息学分析 | 第65页 |
| 2 结果与分析 | 第65-76页 |
| ·目的基因ln 的分离 | 第65-76页 |
| ·目的基因ln 中间片段的分离 | 第65-66页 |
| ·目的基因ln cDNA 3’-末端的分离 | 第66-70页 |
| ·目的基因ln 全长cDNA 的克隆 | 第70-71页 |
| ·目的基因ln 序列的核苷酸分析 | 第71-72页 |
| ·目的基因ln 的氨基酸序列分析 | 第72-74页 |
| ·目的基因ln 的氨基酸序列同源性比较 | 第74-76页 |
| 3 讨论 | 第76-80页 |
| ·关于研究结果 | 第76-77页 |
| ·关于研究方法 | 第77-80页 |
| 第三章 疏棉状嗜热丝孢菌热稳定脂肪酶基因在毕赤酵母中的表达 | 第80-122页 |
| 第一节 疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶LGY 在毕赤酵母中的表达 | 第81-107页 |
| 1 材料和方法 | 第81-94页 |
| ·材料 | 第81-83页 |
| ·菌株和质粒 | 第81页 |
| ·酶和生化试剂 | 第81页 |
| ·培养基及有关溶液的配制 | 第81-82页 |
| ·主要仪器设备 | 第82-83页 |
| ·实验方法 | 第83-94页 |
| ·脂肪酶LGY 成熟肽基因序列的分离 | 第83-84页 |
| ·脂肪酶 LGY 成熟肽基因序列的限制性酶切位点分析 | 第83页 |
| ·引物设计以及LGY 成熟肽基因序列的分离 | 第83-84页 |
| ·脂肪酶基因lgy 在毕赤酵母中的表达 | 第84-94页 |
| ·酵母表达载体的构建 | 第84-85页 |
| ·线性化质粒DNA 的制备 | 第85页 |
| ·酵母转化 | 第85-87页 |
| ·Pichia pastoris G5115 感受态细胞的制备（电击法） | 第85-86页 |
| ·重组表达质粒pPIC9K/lgy 电击转化酵母感受态细胞 | 第86-87页 |
| ·酵母转化子的筛选与鉴定 | 第87-88页 |
| ·酵母转化子甲醇利用表型的平板筛选 | 第87页 |
| ·酵母基因组DNA 的分离 | 第87-88页 |
| ·酵母转化子的PCR 鉴定 | 第88-90页 |
| ·pPIC9K AOX1 通用引物鉴定 | 第88-89页 |
| ·脂肪酶lgy 基因的特异性引物鉴定 | 第89-90页 |
| ·外源基因多拷贝整合转化子筛选 | 第90-91页 |
| ·酵母工程菌的培养和脂肪酶LGY 的诱导分泌表达 | 第91页 |
| ·表达产物的生物学活性检测 | 第91-92页 |
| ·表达产物的SDS-PAGE 分析 | 第92页 |
| ·脂肪酶工程菌产酶曲线及产酶期间生长曲线的测定 | 第92页 |
| ·脂肪酶工程菌的遗传稳定性分析 | 第92页 |
| ·脂肪酶工程菌表达产物的酶学性质 | 第92-94页 |
| ·反应最适温度 | 第92-93页 |
| ·反应最适pH 值 | 第93页 |
| ·热稳定性 | 第93页 |
| ·pH 稳定性 | 第93页 |
| ·各种金属离子对脂肪酶活性的影响 | 第93-94页 |
| 2 结果与分析 | 第94-107页 |
| ·脂肪酶LGY 成熟肽基因序列的酶切位点分析和扩增 | 第94-95页 |
| ·脂肪酶基因lgy 在毕赤酵母中的表达 | 第95-107页 |
| ·酵母表达载体的构建和鉴定 | 第95-97页 |
| ·重组酵母表达质粒pPIC9K/lgy 转化 Pichia pastoris GS115及酵母转化子的筛选 | 第97-100页 |
| ·酵母转化子的甲醇利用表型的筛选 | 第97-98页 |
| ·酵母转化子的PCR 鉴定 | 第98-99页 |
| ·lgy 基因多拷贝整合子的筛选 | 第99-100页 |
| ·疏棉状嗜热丝孢菌热稳定脂肪酶基因lgy 在Pichia pastoris 中的高效表达及表达产物的检测 | 第100-102页 |
| ·脂肪酶基因lgy 在Pichia pastoris 中的诱导表达和高表达酵母菌株的筛选 | 第100页 |
| ·脂肪酶酵母工程菌产酶曲线及产酶期间生长曲线的测定 | 第100-101页 |
| ·脂肪酶基因lgy 表达产物的SDS-PAGE 检测 | 第101-102页 |
| ·脂肪酶酵母工程菌的遗传稳定性分析 | 第102页 |
| ·表达脂肪酶LGY 的酶学性质研究 | 第102-107页 |
| ·表达脂肪酶LGY 的纯化 | 第102-103页 |
| ·表达脂肪酶LGY 的最适反应温度 | 第103-104页 |
| ·表达脂肪酶LGY 的最适反应pH 值 | 第104页 |
| ·表达脂肪酶LGY 的热稳定性 | 第104-105页 |
| ·表达脂肪酶LGY 的pH 稳定性 | 第105页 |
| ·金属离子对表达脂肪酶LGY 活性的影响 | 第105-107页 |
| 第二节 疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶LN 在毕赤酵母中的表达 | 第107-122页 |
| 1 材料和方法 | 第107-108页 |
| ·材料 | 第107页 |
| ·实验方法 | 第107-108页 |
| ·脂肪酶LN 成熟肽基因序列的分离 | 第107-108页 |
| ·脂肪酶LN 成熟肽基因序列的限制性酶切位点分析 | 第107页 |
| ·引物设计以及LN 成熟肽基因序列的分离 | 第107-108页 |
| ·脂肪酶基因ln 在毕赤酵母中的表达 | 第108页 |
| 2 结果与分析 | 第108-118页 |
| ·脂肪酶LN 成熟肽基因序列的酶切位点分析和扩增 | 第108-109页 |
| ·脂肪酶基因ln 在毕赤酵母中的表达 | 第109-118页 |
| ·酵母表达载体的构建和鉴定 | 第109-111页 |
| ·重组酵母表达质粒pPIC9K/ln 转化 Pichia pastoris GS115 及酵母转化子的筛选 | 第111页 |
| ·疏棉状嗜热丝孢菌热稳定脂肪酶基因ln 在Pichia pastoris 中的高效表达及表达产物的检测 | 第111-114页 |
| ·脂肪酶基因ln 在Pichia pastoris 中的诱导表达和高表达酵母菌株的筛选 | 第111-112页 |
| ·脂肪酶酵母工程菌产酶曲线的测定 | 第112页 |
| ·甲醇的体积分数对脂肪酶产量的影响 | 第112页 |
| ·脂肪酶基因ln 表达产物的SDS-PAGE 检测 | 第112-114页 |
| ·脂肪酶酵母工程菌的遗传稳定性分析 | 第114页 |
| ·表达脂肪酶LN 的酶学性质研究 | 第114-118页 |
| ·表达脂肪酶LN 的纯化 | 第114-115页 |
| ·表达脂肪酶LN 的最适反应温度 | 第115页 |
| ·表达脂肪酶LN 的最适反应pH 值 | 第115-116页 |
| ·表达脂肪酶LN 的热稳定性 | 第116页 |
| ·表达脂肪酶LN 的pH 稳定性 | 第116-117页 |
| ·金属离子对表达脂肪酶LN 活性的影响 | 第117-118页 |
| 3 讨论 | 第118-122页 |
| ·关于研究结果 | 第118-119页 |
| ·关于表达系统 | 第119-122页 |
| 第四章 结论和建议 | 第122-124页 |
| 1 结论 | 第122-123页 |
| 2 建议 | 第123-124页 |
| 参考文献 | 第124-135页 |
| 致谢 | 第135-136页 |
| 攻读硕士期间发表论文和申请专利情况 | 第136页 |
