| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-12页 |
| 前言 | 第12-14页 |
| 第一部分 文献综述 | 第14-27页 |
| 1 稻瘟病菌及其致病过程 | 第14-17页 |
| ·稻瘟病菌与稻瘟病 | 第14-15页 |
| ·稻瘟病菌侵染寄主的过程 | 第15-17页 |
| ·孢子附着 | 第15-16页 |
| ·侵入 | 第16-17页 |
| ·定殖 | 第17页 |
| 2 参与稻瘟病菌附着胞形成的信号转导途径 | 第17-21页 |
| ·cAMP 信号途径 | 第18页 |
| ·MAPK 信号途径 | 第18-20页 |
| ·PMK1 | 第19页 |
| ·MPS1 | 第19页 |
| ·OSM1 | 第19-20页 |
| ·Ca~(2+)信号途径 | 第20-21页 |
| 3 蛋白激酶 | 第21-24页 |
| ·钙/钙调素依赖的蛋白激酶(CaMK) | 第22-23页 |
| ·真菌中 CaMK 研究进展 | 第23-24页 |
| 4 稻瘟病菌致病相关基因研究方法 | 第24-27页 |
| ·基因敲除技术(gene knockout) | 第24-25页 |
| ·RNA 干扰技术(RNAi) | 第25-26页 |
| ·转座子标签技术(transposon tagging) | 第26页 |
| ·过表达(over-expression) | 第26页 |
| ·其他技术 | 第26-27页 |
| 第二部分 研究报告 | 第27-74页 |
| 第一章 稻瘟病菌 CaMK1和 CaMK2基因敲除载体构建 | 第27-45页 |
| 一 实验材料及实验仪器 | 第27-28页 |
| 1 菌株和质粒 | 第27页 |
| 2 试剂和培养基 | 第27页 |
| ·试剂 | 第27页 |
| ·培养基 | 第27页 |
| 3 实验仪器 | 第27-28页 |
| 二 实验方法 | 第28-33页 |
| 1 稻瘟病菌的培养 | 第28页 |
| ·固体培养基培养 | 第28页 |
| ·液体培养基培养 | 第28页 |
| 2 CTAB 法提取稻瘟病菌基因组 DNA | 第28-29页 |
| 3 CaCl_2法制备大肠杆菌细菌感受态 | 第29页 |
| 4 质粒的提取(上海生工) | 第29-30页 |
| 5 酶切 | 第30-31页 |
| 6 连接 | 第31-32页 |
| 7 连接产物的热激转化及转化子的蓝白斑筛选 | 第32页 |
| 8 鉴定 | 第32页 |
| ·PCR 鉴定 | 第32页 |
| ·酶切鉴定 | 第32页 |
| 9 PCR 产物、酶切产物的胶回收(上海生工) | 第32-33页 |
| 三 结果及分析 | 第33-42页 |
| 1 CaMK1基因敲除载体的构建 | 第33-38页 |
| ·CaMK1基因敲除载体的构建策略 | 第33页 |
| ·CaMK1基因上游片段的获得 | 第33-35页 |
| ·CaMK1基因下游片段的获得 | 第35页 |
| ·CaMK1基因敲除载体的第一步重组 | 第35-36页 |
| ·CaMK1基因敲除载体的第二步重组 | 第36-37页 |
| ·CaMK1基因敲除载体的第三步重组 | 第37-38页 |
| 2 CaMK2基因敲除载体的构建 | 第38-42页 |
| ·CaMK2基因敲除载体的构建策略 | 第38页 |
| ·CaMK2基因上游片段的获得 | 第38-40页 |
| ·CaMK2基因下游片段的获得 | 第40页 |
| ·CaMK2基因敲除载体的第一步重组 | 第40-41页 |
| ·CaMK2基因敲除载体的第二步重组 | 第41-42页 |
| ·CaMK2基因敲除载体的第三步重组 | 第42页 |
| 四 讨论 | 第42-45页 |
| 第二章 稻瘟病菌 CaMK1的转化及转化子分析 | 第45-65页 |
| 一 实验材料及实验仪器 | 第45-47页 |
| 1 材料 | 第45页 |
| 2 试剂和培养基 | 第45-46页 |
| ·试剂 | 第45-46页 |
| ·原生质体制备及转化所用试剂 | 第45页 |
| ·DNA 提取所用试剂 | 第45页 |
| ·Southern blot 试剂 | 第45-46页 |
| ·其他试剂用品 | 第46页 |
| ·培养基 | 第46页 |
| 3 实验仪器 | 第46-47页 |
| 二 实验方法 | 第47-54页 |
| 1 稻瘟病菌 CaMK1的转化 | 第47-49页 |
| ·稻瘟病菌菌丝球的获得 | 第47页 |
| ·稻瘟病菌原生质体的制备 | 第47-48页 |
| ·含 CaMK1敲除载体的质粒的提取(参照第一章方法4) | 第48页 |
| ·酶切 | 第48页 |
| ·PEG 介导的原生质体的转化 | 第48页 |
| ·转化子的抗性初筛 | 第48页 |
| ·PCR 鉴定 | 第48-49页 |
| 2 Southern blot | 第49-53页 |
| ·提取用于 Southern blot 的稻瘟病菌基因组 DNA | 第49-50页 |
| ·DNA 的酶切 | 第50页 |
| ·酶切后 DNA 的电泳、变性及中和 | 第50-51页 |
| ·转膜 | 第51页 |
| ·探针的制备 | 第51页 |
| ·探针的标记(Roche 地高辛标记试剂盒) | 第51页 |
| ·探针标记效率的检测(Roche 地高辛标记试剂盒) | 第51-52页 |
| ·预杂交和杂交(Roche 地高辛标记试剂盒) | 第52页 |
| ·杂交后的洗膜与免疫检测 | 第52-53页 |
| 3 生物学性状分析 | 第53-54页 |
| ·菌种的活化 | 第53页 |
| ·菌丝生长速率的测定 | 第53页 |
| ·分生孢子的收集 | 第53页 |
| ·分生孢子萌发和附着胞形成的观察 | 第53-54页 |
| 三 结果分析 | 第54-61页 |
| 1 稻瘟病菌 CaMK1转化子的获得 | 第54-56页 |
| ·稻瘟病菌菌丝球被酶消化前后 | 第54页 |
| ·获得的用于转化的原生质体 | 第54页 |
| ·PEG 介导的转化获得的 CaMK1转化子的情况 | 第54-55页 |
| ·转化子 PCR 鉴定结果 | 第55-56页 |
| 2 稻瘟病菌 CaMK1转化子的 Southern blot 验证 | 第56-59页 |
| ·杂交检测的策略 | 第56-57页 |
| ·探针的获得 | 第57页 |
| ·探针标记效率的检测 | 第57页 |
| ·基因组 DNA 酶切效果检测 | 第57-58页 |
| ·Southern blot 验证结果 | 第58-59页 |
| 3 转化子 K1-1、K1-2的生物学性状分析 | 第59-61页 |
| ·转化子 K1-1、K1-2的菌落形态特征 | 第59-60页 |
| ·转化子菌丝生长测定 | 第60-61页 |
| ·转化子的产孢量与野生型的比较 | 第61页 |
| ·转化子分生孢子萌发及附着孢形成的观察 | 第61页 |
| 四 讨论 | 第61-65页 |
| 第三章 稻瘟病菌 CaMK1基因 RNAi 载体构建及转化 | 第65-74页 |
| 一 实验材料及实验仪器 | 第65-66页 |
| 1 菌株及质粒 | 第65页 |
| 2 试剂和培养基 | 第65页 |
| ·试剂 | 第65页 |
| ·培养基 | 第65页 |
| 3 实验仪器 | 第65-66页 |
| 二 实验方法 | 第66-70页 |
| 1 CTAB 法提取稻瘟病菌基因组 DNA(参见第一章方法2) | 第66页 |
| 2 CaCl_2法制备大肠杆菌感受态(参见第一章方法3) | 第66页 |
| 3 质粒的提取(北京天根) | 第66-67页 |
| 4 PCR 产物、酶切产物琼脂糖凝胶回收(北京天根) | 第67页 |
| 5 酶切 | 第67-68页 |
| 6 连接 | 第68页 |
| 7 将连接体系转入大肠杆菌感受态中(参见第一章方法7) | 第68页 |
| 8 对构建的载体正确性的验证(参见第一章方法8) | 第68页 |
| 9 将构建好的 CaMK1基因 RNAi 载体利用 PEG 介导的转化转入到稻瘟病菌中(参见第二章方法1.5) | 第68页 |
| 10 转化子的抗性初筛(参见第二章方法1.6) | 第68页 |
| 11 转化子生物学性状分析(参见第二章方法3) | 第68页 |
| 12 对性状出现差异的转化子的鉴定 | 第68-70页 |
| ·PCR 鉴定(参见第二章方法1.7) | 第68-69页 |
| ·RNA 水平上的鉴定(Trizol 法提取稻瘟病菌总 RNA) | 第69-70页 |
| 三 结果分析 | 第70-73页 |
| 1 CaMK1基因 RNAi 载体构建策略 | 第70-71页 |
| 2 CaMK1基因 RNAi 载体构建片段的获得 | 第71-72页 |
| 3 CaMK1基因 RNAi 载体的第一步重组 | 第72页 |
| 4 CaMK1基因 RNAi载体的第二步重组 | 第72-73页 |
| 5 PEG 介导的转化获得的转化子情况 | 第73页 |
| 四 讨论 | 第73-74页 |
| 结论 | 第74-75页 |
| 参考文献 | 第75-84页 |
| 致谢 | 第84页 |
